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背景：
缺血性脑血管病(ischemic cerebro vascular disease,ICVD)是危及人类生命健康的常见病,是人类致死致残的最主要原因之一。近年来,从整体水平及细胞分子水平,就ICVD的病理生理进行了广泛而深入的研究,取得了较大进展。脑缺血后自身“代偿性血管生成”,为ICVD病理机制研究提供了新的思路,但目前实验研究多以青年动物为研究对象,其结论与ICVD多发于老龄人群的临床实际相距甚远。老年患者发病率及死亡率较高的原因与其易感性和患病后损伤的严重性密切相关。中医药治疗ICVD疗效确切,目前就其针对ICVD治疗作用机制方面的研究虽已取得一定进展,但有关脑缺血/再灌注损伤后血管生成影响方面的研究鲜见报道。本课题在以前研究的基础上,从细胞、分子、基因水平探讨老龄大鼠脑缺血/再灌注脑微血管生成机制,并从相关因子表达方面进一步阐释中药复方脑脉通对微血管生成的促进作用及其可能的作用机制。
目的：
1.通过对老龄大鼠血管生成有关方面的研究,探讨老年脑缺血/再灌注损伤的病理生理特点。
2.从老龄大鼠脑缺血/再灌注脑微血管生成方面揭示老年脑缺血/再灌注血管生成机制。
3.探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注促血管生成的作用机制。
4.通过促血管生成作用,评价脑脉通对老年脑缺血/再灌注损伤的保护作用。
方法：
1.运用电镜、免疫组化、原位杂交等技术比较青年和老龄大鼠脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d神经功能评分、脑组织含水量、梗死面积、脑组织超微结构、细胞凋亡、微血管生成等指标的时程变化以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGF-receptor,VEGFR)Fms样络氨酸激酶-1(Fms-re lated tyrosinekinase-1,Flt-1)、胚胎肝激酶-1/含激酶插入结构域受体(fetal liver kianse-1,Flk-1/kinaseinsert domain-containing receptor,KDR)的蛋白与基因表达。
2.研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注血管生成作用,从VEGF、VEGFR蛋白及其基因表达变化方面研究脑脉通促进血管生成的可能作用机制。
结果：
1.老龄大鼠脑缺血损伤特点、脑缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)后脑微血管生成规律及脑脉通促脑微血管生成作用
①神经功能障碍评分:老龄模型组I/R1d、3d高于青年模型组相同时点(P<0.05),老龄大鼠I/R1d神经功能评分最高;脑脉通组I/R1d、3d低于老龄模型组同时间点(P<0.05,P<0.01)。②梗死面积:老龄模型组I/R1d、3d、6d、12d高于青年模型组相同时点(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠I/R1d梗死面积开始增大,持续升高至6d达峰值,其峰值显著高于青年大鼠(P<0.01);脑脉通组除I3h外,其余各时间点均低于老龄模型组(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R6d降低(P<0.01)。③脑组织含水量:老龄大鼠I/R1d即出现明显脑水肿,持续至6d以后脑水肿开始明显减轻;脑脉通组I/R1d、3d均低于老龄模型组同时间点(P<0.05)。④脑细胞超微结构:模型经脑脉通治疗后,I3h~I/R3d神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞超微结构总体变化与老龄模型组无显著变化;I/R3d以后脑细胞超微结构病理变化明显减轻,线粒体仅有轻度水肿,嵴部分消失,膜部分消失,粗面内质网正常,其余细胞器正常;I/R12d细胞质、胞核、细胞器基本正常。⑤脑微血管超微结构变化:脑脉通组I3h~I/R3d血管病理变化不明显;I/R3d以后血管病理改善显著,可见毛细血管周围轻度水肿,吞饮泡减少,微绒毛减少,线粒体轻度水肿,基底膜仅有轻度缺损,局部水肿;I/R12d血管超微结构基本恢复正常。⑥细胞凋亡:与青年组相同时间点比较,老龄假手术组、老龄模型组I/R3d、6d细胞凋亡数增多(P<0.01),老龄模型大鼠细胞凋亡数于I/R3d达到峰值;与老龄模型组相同时间点比较,尼莫地平组和脑脉通组I/R1d、3d、6d、12d细胞凋亡数均减少(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R3d、6d细胞凋亡数减少(P<0.01)。⑦脑微血管密度(microvesseldensity,MVD)及血管场面积:与青年组同时间点相比,老龄假手术组MVD增高(P<0.01),老龄模型组I/R1d、3d、6d、12dMVD及场面积均降低(P<0.05,P<0.01),老龄模型组MVD自造模后至I/R12d一直呈持续下降状态,血管场面积于I/R1d达峰值,后逐渐降低;与老龄模型组比,脑脉通组I3h、I/R1d、3d、12dMVD升高(P<0.01),脑脉通组I3h、I/R3d、6d、12d血管场面积增加(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平同时间点比较,脑脉通组I/R12dMVD升高(P<0.01),I3h血管场面积增加(P<0.01)。
2.老龄大鼠脑I/RVEGF/VEGFR系统蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响
①VEGF表达变化:与青年组相同时间点比较,老龄假手术组及老龄模型组I3h、I/R3d、6d、12d表达均减弱(P<0.01),老龄组表达峰值出现在I/R1d,I/R1d~3d呈逐渐减弱趋势,I/R3d~6d又逐渐增强,后又减弱;脑脉通组各时间点表达均高于老龄模型组(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I3h、I/R6d、12d表达增强(P<0.01)。②Flt-1表达变化:与青年组比,老龄假手术组及老龄模型组I3h、I/R1d、3d表达增强(P<0.01),其余各时间点表达均减弱(P<0.01),老龄模型组I3h表达开始增强,I/R1d达到峰值,I/R3d~12d表达逐步下降;脑脉通组各时间点表达均分别高于老龄模型组及尼莫地平组(P<0.01)。③Flk-1表达变化:与青年组比,老龄假手术组及老龄模型组I3h表达增强(P<0.01),老龄模型组I/R3d、6d、12d表达均减弱(P<0.01),老龄模型组表达时程规律与Flt-1基本一致;脑脉通组各时间点表达均高于老龄模型组(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R1d、6d、12d表达增强(P<0.05,P<0.01),I/R3d表达减弱(P<0.01)。
3.老龄大鼠脑I/RVEGF/VEGFR系统基因表达时程变化及脑脉通对其表达的影响
①VEGFmRNA表达变化:老龄假手术组及老龄模型组I3h、I/R1d、3d、12d表达均低于青年组(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠表达于I/R1d达到峰值,I/R6d表达降至最低,此后又逐步增强;脑脉通组I3h、I/R3d、6d、12d表达均较老龄模型组增高(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R1d表达降低(P<0.05),其余各时间点表达均增高(P<0.01)。②Flt-1mRNA表达变化:与青年模型组相同时间点比较,老龄模型组I/R1d、3d、6d、12d表达均降低(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠表达于I/R1d最强,此后迅速减弱;脑脉通组各时间点表达均较老龄模型组增高(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I3h、I/R6d、12d表达增高(P<0.05)。③Flk-1mRNA表达变化:与青年模型组相同时间点比较,老龄模型组I/R3d、6d、12d表达降低(P<0.01),老龄模型组表达时程规律与Flt-1mRNA基本一致;脑脉通组各时间点表达均较老龄模型组增高(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R6d、12d表达增高(P<0.01)。
结论：
1.随着增龄,老龄大鼠脑缺血/再灌注脑组织损伤出现早、程度重、恢复慢,脑缺血损伤后微血管生成减弱,脑微血管数量较青年大鼠明显减少。这可能是老年ICVD病情较重、致残率和死亡率较高的病理生理机制之一。
2.老龄大鼠脑缺血/再灌注后促血管生成因子VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的蛋白表达明显减少,mRNA表达显著减弱,这可能是老年微血管生成迟缓的主要机制。
3.脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管生成有明显促进作用,其作用机制可能与提高VEGF/VEGFR系统蛋白表达及上调其mRNA表达水平有关。
4.脑脉通通过促微血管生成对脑缺血/再灌注损伤有明显的保护作用。
缺血性脑血管病(ischemic cerebro vascular disease,ICVD)是危及人类生命健康的常见病,是人类致死致残的最主要原因之一。近年来,从整体水平及细胞分子水平,就ICVD的病理生理进行了广泛而深入的研究,取得了较大进展。脑缺血后自身“代偿性血管生成”,为ICVD病理机制研究提供了新的思路,但目前实验研究多以青年动物为研究对象,其结论与ICVD多发于老龄人群的临床实际相距甚远。老年患者发病率及死亡率较高的原因与其易感性和患病后损伤的严重性密切相关。中医药治疗ICVD疗效确切,目前就其针对ICVD治疗作用机制方面的研究虽已取得一定进展,但有关脑缺血/再灌注损伤后血管生成影响方面的研究鲜见报道。本课题在以前研究的基础上,从细胞、分子、基因水平探讨老龄大鼠脑缺血/再灌注脑微血管生成机制,并从相关因子表达方面进一步阐释中药复方脑脉通对微血管生成的促进作用及其可能的作用机制。
目的：
1.通过对老龄大鼠血管生成有关方面的研究,探讨老年脑缺血/再灌注损伤的病理生理特点。
2.从老龄大鼠脑缺血/再灌注脑微血管生成方面揭示老年脑缺血/再灌注血管生成机制。
3.探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注促血管生成的作用机制。
4.通过促血管生成作用,评价脑脉通对老年脑缺血/再灌注损伤的保护作用。
方法：
1.运用电镜、免疫组化、原位杂交等技术比较青年和老龄大鼠脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d神经功能评分、脑组织含水量、梗死面积、脑组织超微结构、细胞凋亡、微血管生成等指标的时程变化以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGF-receptor,VEGFR)Fms样络氨酸激酶-1(Fms-re lated tyrosinekinase-1,Flt-1)、胚胎肝激酶-1/含激酶插入结构域受体(fetal liver kianse-1,Flk-1/kinaseinsert domain-containing receptor,KDR)的蛋白与基因表达。
2.研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注血管生成作用,从VEGF、VEGFR蛋白及其基因表达变化方面研究脑脉通促进血管生成的可能作用机制。
结果：
1.老龄大鼠脑缺血损伤特点、脑缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)后脑微血管生成规律及脑脉通促脑微血管生成作用
①神经功能障碍评分:老龄模型组I/R1d、3d高于青年模型组相同时点(P<0.05),老龄大鼠I/R1d神经功能评分最高;脑脉通组I/R1d、3d低于老龄模型组同时间点(P<0.05,P<0.01)。②梗死面积:老龄模型组I/R1d、3d、6d、12d高于青年模型组相同时点(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠I/R1d梗死面积开始增大,持续升高至6d达峰值,其峰值显著高于青年大鼠(P<0.01);脑脉通组除I3h外,其余各时间点均低于老龄模型组(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R6d降低(P<0.01)。③脑组织含水量:老龄大鼠I/R1d即出现明显脑水肿,持续至6d以后脑水肿开始明显减轻;脑脉通组I/R1d、3d均低于老龄模型组同时间点(P<0.05)。④脑细胞超微结构:模型经脑脉通治疗后,I3h~I/R3d神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞超微结构总体变化与老龄模型组无显著变化;I/R3d以后脑细胞超微结构病理变化明显减轻,线粒体仅有轻度水肿,嵴部分消失,膜部分消失,粗面内质网正常,其余细胞器正常;I/R12d细胞质、胞核、细胞器基本正常。⑤脑微血管超微结构变化:脑脉通组I3h~I/R3d血管病理变化不明显;I/R3d以后血管病理改善显著,可见毛细血管周围轻度水肿,吞饮泡减少,微绒毛减少,线粒体轻度水肿,基底膜仅有轻度缺损,局部水肿;I/R12d血管超微结构基本恢复正常。⑥细胞凋亡:与青年组相同时间点比较,老龄假手术组、老龄模型组I/R3d、6d细胞凋亡数增多(P<0.01),老龄模型大鼠细胞凋亡数于I/R3d达到峰值;与老龄模型组相同时间点比较,尼莫地平组和脑脉通组I/R1d、3d、6d、12d细胞凋亡数均减少(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R3d、6d细胞凋亡数减少(P<0.01)。⑦脑微血管密度(microvesseldensity,MVD)及血管场面积:与青年组同时间点相比,老龄假手术组MVD增高(P<0.01),老龄模型组I/R1d、3d、6d、12dMVD及场面积均降低(P<0.05,P<0.01),老龄模型组MVD自造模后至I/R12d一直呈持续下降状态,血管场面积于I/R1d达峰值,后逐渐降低;与老龄模型组比,脑脉通组I3h、I/R1d、3d、12dMVD升高(P<0.01),脑脉通组I3h、I/R3d、6d、12d血管场面积增加(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平同时间点比较,脑脉通组I/R12dMVD升高(P<0.01),I3h血管场面积增加(P<0.01)。
2.老龄大鼠脑I/RVEGF/VEGFR系统蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响
①VEGF表达变化:与青年组相同时间点比较,老龄假手术组及老龄模型组I3h、I/R3d、6d、12d表达均减弱(P<0.01),老龄组表达峰值出现在I/R1d,I/R1d~3d呈逐渐减弱趋势,I/R3d~6d又逐渐增强,后又减弱;脑脉通组各时间点表达均高于老龄模型组(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I3h、I/R6d、12d表达增强(P<0.01)。②Flt-1表达变化:与青年组比,老龄假手术组及老龄模型组I3h、I/R1d、3d表达增强(P<0.01),其余各时间点表达均减弱(P<0.01),老龄模型组I3h表达开始增强,I/R1d达到峰值,I/R3d~12d表达逐步下降;脑脉通组各时间点表达均分别高于老龄模型组及尼莫地平组(P<0.01)。③Flk-1表达变化:与青年组比,老龄假手术组及老龄模型组I3h表达增强(P<0.01),老龄模型组I/R3d、6d、12d表达均减弱(P<0.01),老龄模型组表达时程规律与Flt-1基本一致;脑脉通组各时间点表达均高于老龄模型组(P<0.05,P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R1d、6d、12d表达增强(P<0.05,P<0.01),I/R3d表达减弱(P<0.01)。
3.老龄大鼠脑I/RVEGF/VEGFR系统基因表达时程变化及脑脉通对其表达的影响
①VEGFmRNA表达变化:老龄假手术组及老龄模型组I3h、I/R1d、3d、12d表达均低于青年组(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠表达于I/R1d达到峰值,I/R6d表达降至最低,此后又逐步增强;脑脉通组I3h、I/R3d、6d、12d表达均较老龄模型组增高(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R1d表达降低(P<0.05),其余各时间点表达均增高(P<0.01)。②Flt-1mRNA表达变化:与青年模型组相同时间点比较,老龄模型组I/R1d、3d、6d、12d表达均降低(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠表达于I/R1d最强,此后迅速减弱;脑脉通组各时间点表达均较老龄模型组增高(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I3h、I/R6d、12d表达增高(P<0.05)。③Flk-1mRNA表达变化:与青年模型组相同时间点比较,老龄模型组I/R3d、6d、12d表达降低(P<0.01),老龄模型组表达时程规律与Flt-1mRNA基本一致;脑脉通组各时间点表达均较老龄模型组增高(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I/R6d、12d表达增高(P<0.01)。
结论：
1.随着增龄,老龄大鼠脑缺血/再灌注脑组织损伤出现早、程度重、恢复慢,脑缺血损伤后微血管生成减弱,脑微血管数量较青年大鼠明显减少。这可能是老年ICVD病情较重、致残率和死亡率较高的病理生理机制之一。
2.老龄大鼠脑缺血/再灌注后促血管生成因子VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的蛋白表达明显减少,mRNA表达显著减弱,这可能是老年微血管生成迟缓的主要机制。
3.脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管生成有明显促进作用,其作用机制可能与提高VEGF/VEGFR系统蛋白表达及上调其mRNA表达水平有关。
4.脑脉通通过促微血管生成对脑缺血/再灌注损伤有明显的保护作用。