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涡虫是扁形动物门的典型代表,具有许多生物演化进程的过渡性特征,是研究整个生物进化史不可或缺的重要环节。近年来由于其极强的再生能力而越来越受研究者的关注,但主要集中在再生、神经、毒理和发育等方面,而对其免疫方面的研究则相对较少。本文对东亚三角涡虫（Dugesia japonica）进行转录组测序,并从中筛选出了C-型凝集素（C-lectin,CTL）和α2-巨球蛋白（alpha-2 Macroglobulin,α2M,A2M）两个基因进行了基因克隆、进化和功能的研究。首先,基于二代测序技术的涡虫转录组获得了42,877,438条原始数据,经过一系列的质控、除杂和拼接后,最终得到了27,180条可变剪接体,代表了21536个基因。接着,对所拼接序列的长度分布和蛋白覆盖度做了统计分析,检验序列是否满足后续的功能注释分析。随后,对序列分别进行了GO注释和KEGG注释,结果统计发现本次转录组测序,在东亚三角涡虫D.japonica中共获得了246个免疫相关基因,参与了15条KEGG免疫相关信号途径。其次,根据C-lectin部分序列设计引物,扩增和拼接后获得了一个428 bp的cDNA克隆,5’-非翻译区48 bp,3’-非翻译区56 bp,将其命名为DjCTL。DjCTL最大开放阅读框为324 bp,编码一个由108个氨基酸组成全序列的蛋白,其分子量约为11.88 kDa,等电点5.675。该序列N-端没有信号肽序列,有一个扫描序列,C-端具在多聚腺苷酸化信号位点和poly（A）尾。利用NCBI进行BLASTp比对发现该全长序列有且仅有一个CRD,其内存在4个组成二硫键的保守半胱氨酸和2个糖结合位点:EPN和WND。多序列比对发现,DjCTL的CRD与其它物种的有很高的同源性,且与人RegⅠα的相似度最高。对其基因和蛋白定位发现,DjCTL基因主要表达于咽周围,而蛋白则在咽和表皮以及表皮下的实质组织细胞中都有分布,推测可能参与了涡虫机体的免疫防御。LPS和PGN诱导涡虫后,DjCTL的表达明显上调,说明DjCTL确实参与了免疫反应。凝血和凝菌实验发现,DjCTL可以凝集兔血红细胞,可以与革兰氏阴性和阳性菌结合,但只能使革兰氏阴性菌发生钙离子依赖的凝集,革兰氏阳性菌却不凝集。然而,DjCTL引起的菌凝集并不可以抑制菌的生长。进一步研究发现,DjCTL与LPS和PGN都可以进行结合,且与LPS的结合能力大于PGN;也可与甘露糖和半乳糖进行结合,而由于‘EPN’序列的存在,对于前者的结合能力远大于后者。通过以上结果证明DjCTL在涡虫体内是作为一种PRRs来参与免疫应答过程的。有趣的是,再生不同时相的real-timePCR和原位杂交结果显示,在再生涡虫早期阶段DjCTL显著高表达,再生早期主要表达于胚基部位,这都说明DjCTL在再生早期阶段发挥重要作用,与伤口愈合有关。最后,根据A2M部分基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆了一个全长5804 bp,5’-非翻译区128 bp,3’-非翻译区102 bp,含5574 bp ORF的DjA2M基因。该基因N-端含有一长编码20个氨基酸的信号肽,C-端含有多聚腺苷酸化信号位点（AATAAA）和poly（A）尾。DjA2M成熟蛋白编码1837个氨基酸,其分子量约为212 kDa,等电点为8.671,具有30个N-Linked糖基化位点。多序列比对发现DjA2M与其它被鉴定的A2M一样,也含有三个基本的功能区:诱饵区、硫酯区和受体结合区,且相应的保守基序和氨基酸也都存在。系统进化树分析发现涡虫DjA2M位于原口动物基部,与涡虫在进化过程中的地位相一致,是一个比较原始的A2M蛋白。原位杂交结果显示,DjA2M只表达于咽部,说明其可能参与涡虫的免疫应答。LPS和PGN诱导后DjA2M在涡虫体内5 hrs时都显著上调,且相比之下,对PGN的敏感性更强。高浓度dsRNA干扰DjA2M后,涡虫表皮出现溃烂,其体液的溶血活性也受到抑制,且与干扰强度成正相关。因此,我们推测DjA2M参与涡虫免疫并且可能在补体替代途径中发挥重要作用。