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本研究旨在构建杂合抗菌肽AT基因的基因工程表达菌,并分别在原核和真核细胞中表达;通过体内、体外抑菌试验、以小鼠为模型的活体试验初步探讨重组抗菌肽AT的生物学功效。首先通过RT-PCR技术,从大肠杆菌攻毒诱导的果蝇中扩增AttacinA基因,通过SOE-PCR技术结合TD-PCR将编码成熟肽的Attacin A基因（简写为mA）与Thanatin基因首位相连连接在一起形成杂合基因Attacin-Thanatin（简写为AT）,构建原核、真核重组表达菌,表达重组杂合抗菌肽AT及mA。利用宿主菌对抗菌肽分子内源攻击的敏感性,即表达的抗菌肽对宿主菌有抑制作用、从而造成宿主菌的部分“自杀”这一原理,建立体内活性检测方法并利用该方法检测杂合抗菌肽AT的体内抑菌活性,同时对原核表达产物初步纯化后进行体外抑菌试验。为了考察重组抗菌肽在活体上的生物学功效,以小鼠为模型初步探讨了真核表达产物在调控生产性能、免疫功能及肠道形态上的效果。主要研究结果如下:1、采用二步法RT-PCR技术,克隆出了Attacin A基因,电泳分析显示,其条带大小约为732 bp,与预期片段大小相符,测序结果表明,其核苷酸序列与GenBank报道的Attacin A基因同源性高达96%～99%以上,证实已经正确克隆获得Attacin A基因。序列分析显示,该基因完整阅读框包含666 bp,编码221 AA。2、以重组TA克隆质粒pMD-AttA为模板,经两次SOE-PCR技术结合TD-PCR扩增后,扩增出杂合肽基因AT,片段大小约为660 bp。该杂合基因以Attacin AN端的189 AA作为N端,C端为Thanatin C端的18 AA,中间有6 AA柔性接头,总共包含213 AA。3、成功构建杂合基因AT及mA的原核重组表达载体pET-mAT（pe）、pET-mA（pe）,转化宿主菌Rosetta-gamiTM（DE3）pLysS,经过IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析显示,在41.8 kDa、39.2 KDa处有明显的目的条带,与预期目的蛋白分子量理论值一致,表明Rosetta-gamiTM（DE3）pLysS可成功表达AT、mA抗菌肽。4、将重组表达载体pET-mAT（pe）依次转化宿主菌E.coli DH5α、BL21（DE）、Rosetta-gamiTM（DE3）pLysS,采用IPTG诱导表达;通过优化选择该抗菌肽的敏感菌株、诱导剂IPTG浓度、宿主菌诱导起始浓度等初步建立抗菌肽菌内抑菌活性检测方法,并研究了该杂合抗菌肽体内抑菌活性。结果表明以E.coli DH5α为宿主菌、0.1 mmol/LIPTG为工作浓度、D（600nm）值0.3为起始诱导菌浓度检测抗菌肽菌内抑菌活性方法合理可行;AT融合表达产物抑菌活性检测显示,宿主菌E.coli DH5α被本身所表达的杂合抗菌肽所抑制,增殖速度明显较对照菌放缓。5、本试验采用Ni2+-NTA agarose beads通过His标签纯化目的蛋白,并初步探讨了该抗菌肽的抑菌活性。结果表明,本试验所获得的抗菌肽AT及mA对E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、猪霍乱沙门菌、金黄色葡萄球菌具有抑菌活性,其中对大肠杆菌最为敏感。溶血试验表明,其对猪的红细胞几乎没有溶血活性。6、为了检测AT及mA在哺乳动物Vero细胞中的表达特点,试验首先构建增强型绿包荧光蛋白EGFP重组报告载体,通过对细胞绿色荧光的观察来确定该基因在哺乳动物细胞中表达的可行性及表达规律。结果显示,构建的重组真核报告表达载体pEGFP-mAT（ee）、pEGFP-mA（ee）,转染到哺乳动物细胞Vero中后,AT及mA基因均可在Vero细胞中获得绿色荧光蛋白融合表达产物,72 h时融合蛋白表达量最大,绿色荧光定位观察显示,表达的融合蛋白可以分泌到细胞外。试验进一步构建了重组真核表达载体pCI-mAT（ee）、pCI-mA（ee）,转染到Vero细胞中进行表达。根据上述表达特点在转染后72 h检测表达结果,SDS-PAGE电泳显示在23.54 kDa、20.9 kDa处出现目的蛋白条带,大小与预期蛋白分子量理论值基本一致,说明杂合抗菌肽AT及抗菌肽mA均可在Vero细真核胞中获得纯表达。同时收集细胞培养液上清备用。7、通过检测细胞培养液上清对受试菌株的抑菌活性,发现高浓度细胞培养液上清较低浓度的能够更好地抑制细菌的生长,说明该上清中含有目的抗菌肽,可以作为进一步小鼠试验研究的素材。8、选择80只3～4周龄、平均体重为14.2±1.03 g（平均数±标准差）的断奶小鼠随机分为4组,每组5个重复,连续7天腹腔注射含有抗菌肽AT、mA的细胞培养液上清,正常细胞的培养液上清、氨苄西林作为对照。于第8天大肠杆菌攻毒后继续饲养一周。我们发现连续7天腹腔注射含有抗菌肽AT及mA的细胞培养液上清后,AT杂合抗菌肽组小鼠的日增重较其他3组均略有提高,分别比mA组、细胞培养液上清及抗生素组提高了14.7%、13.8%及12.1%,但差异均不显著。而mA组与细胞培养液上清及抗生素组几乎没有差异。攻毒后的一周内,AT杂合抗菌肽组小鼠的生长性能则分别较mA组、细胞培养液上清及抗生素组提高了34.18%、53.62%及17.78%,其中与细胞培养液上清对照组相比差异达到显著水平（p＜0.05）。从试验全期来看,AT杂合抗菌肽组小鼠的日增重与mA组及细胞培养液上清组比较明显提高（p＜0.05）,提高幅度达25%,而与抗生素组差异不显著。连续腹腔注射重组蛋白后,发现其对胸腺、脾脏的相对重量、十二指肠的绒毛高度没有影响,却极显著增加了空肠的绒毛高度,mA组、AT杂合抗菌肽组小鼠分别较细胞培养液上清组升高了77.4%、74.2%（p＜0.01）。对十二指肠隐窝深度有一定的改善,mA组、AT杂合抗菌肽组小鼠分别较细胞培养液上清组下降了16.99%（p＜0.01）、11.12%（p＞0.05）。攻毒后,与对照组相比,重组抗菌肽组小鼠十二指肠、空肠的隐窝深度均较对照组降低,其中AT及mA组小鼠十二指肠隐窝深度分别较抗生素组降低了11.3%（p＜0.05）、15.38%（p＜0.01）;空肠隐窝深度分别较抗生素组降低了4.8%、7.14%,差异均不显著。注射重组抗菌肽后,小鼠血清中的免疫球蛋白IgM、IL-1β的水平明显提高,而攻毒后,IL-1β的水平较对照组下降。结论:本研究成功构建了抗菌肽基因AT、mA的原核、真核基因工程表达菌,并通过体内、体外试验表明了重组抗菌肽AT、mA对大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、金黄色葡萄球菌等具有抑菌活性,其中对大肠杆菌最为敏感;通过以小鼠为模型的活体试验证明了该重组抗菌肽在调控小鼠的生产性能、免疫功能及肠道形态上具有较好的生物学功效。