【研究背景】:溴结构域(Bromodomain)是一种保守的蛋白结构域,它能够与组蛋白中的乙酰化赖氨酸相结合。BET(Bromodomain and extraterminal)蛋白是一种包含溴结构域的蛋白。BET蛋白可以选择性地与组蛋白尾部的乙酰化赖氨酸残基相结合。通过这种相互作用,包含溴结构域的蛋白能够使细胞核大分子复合体到染色质的特定区域,从而调节一系列重要的生物学活动。BET家族包括Brd2、Brd3、Brd4和Brdt,其中Brd4又包含了Brd4A、Brd4B、Brd4C三种亚型。在BET家族中研究最多最广泛的则是Brd4。BET蛋白的致癌功能在睾丸核蛋白中线癌中第一次被证实。最近有报道证实,通过si RNA文库筛选发现,在急性髓性白血病中沉默Brd4基因会导致c-Myc表达下调,减少白血病干细胞的数量,从而抑制癌症的进一步发展。近些年Brd4的小分子抑制剂发展迅速,其中包括了JQ1、I-BET 151和CPI203等。JQ1是Brd4蛋白的小分子抑制剂。它可以竞争性的与BET溴结构域相结合,使BET蛋白从染色质的乙酰化赖氨酸上置换下来。无论体外实验还是体内实验,在多种造血系统癌症和NUT中线癌中JQ1都有效抑制了BET溴结构域,抗癌作用显著。研究表明,JQ1可以使c-Myc的表达显著下调,而c-Myc在恶性脑胶质瘤小鼠模型中发挥了重要的促进癌症转移和维持恶性胶质瘤干细胞活性的作用,提示应用JQ1治疗恶性脑胶质瘤具有广阔的应用前景。【目的】:为了探讨Brd4选择性抑制剂JQ1对于恶性脑胶质瘤始动细胞的作用及机制,采用JQ1作用于小鼠脑胶质瘤始动细胞CSC1589,实验观察JQ1对CSC1589细胞增殖能力、自我更新能力和凋亡的影响,证实Brd4可以作为恶性胶质瘤潜在的药物靶点,并且初步探讨其作用机制。【方法】:CCK8、细胞生长计数、神经球成球能力实验检测Brd4选择性抑制剂JQ1对小鼠脑胶质瘤始动细胞CSC1589细胞增殖和自我更新能力的影响。免疫荧光染色检测JQ1对小鼠脑胶质瘤始动细胞干细胞标志物表达情况的影响。Annexin V-FITC流式细胞术、Hochest染色检测JQ1对CSC1589细胞凋亡的影响。PI流式细胞术检测JQ1对脑神经胶质瘤周期的影响。q-PCR和Western blot检测CSC1589细胞中Brd4下游基因c-Myc及凋亡、周期相关基因的表达水平。【结果】:通过CCK8实验我们分别在24小时和48小时两个时间点检测了不同浓度的JQ1对小鼠脑胶质瘤始动细胞CSC1589增殖能力的影响。结果显示,JQ1药物浓度越高对细胞生长的抑制作用越明显,呈现明显的剂量依赖性。后续实验中我们选择的JQ1药物浓度为125 nmol/L和250 nmol/L。细胞生长计数实验结果表明:与对照组相比,JQ1加药组细胞数量明显减少,这表明JQ1能够抑制脑胶质瘤始动细胞的增殖,并且高浓度的JQ1(250nmol/L)抑制效果更为明显。神经球成球能力实验结果表明,与对照组相比,JQ1加药组神经球个数明显减少,实验结果提示JQ1有效地抑制了肿瘤始动细胞的自我更新能力,并且高浓度的JQ1(250 nmol/L)抑制效果更为明显。Annexin V-FITC流式细胞术和Hochest染色检测细胞凋亡的结果显示,与对照组相比,加入JQ1后凋亡细胞数量明显增多,JQ1有效诱导了CSC1589细胞的凋亡。PI流式细胞术检测细胞周期的结果显示,JQ1使细胞周期停滞在G1期的比例增加,S期减少,使细胞不能正常进入分裂期。免疫荧光染色结果显示,与对照组相对比JQ1加药组干细胞标志物Nestin的表达量明显减少,实验结果提示了JQ1可以有效地降低脑胶质瘤始动细胞CSC1589的干细胞活性。q-PCR结果显示,JQ1加药组Brd4的下游基因c-Myc的m RNA表达受到了抑制,促凋亡基因的m RNA表达水平明显高于对照组,抗凋亡基因的m RNA表达水平低于对照组,周期相关基因的m RNA表达水平低于对照组。Western blot结果显示,与对照组相比,JQ1加药组Brd4的下游基因c-Myc的蛋白表达水平明显减少,抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达明显较少,促凋亡基因Bax的表达明显增多。【结论】:Brd4选择性抑制剂JQ1可以有效地抑制脑胶质瘤始动细胞的增殖和自我更新能力,促进胶质瘤细胞的凋亡,使细胞产生周期阻滞现象,最终能够达到抑制肿瘤的目的。本研究揭示了Brd4可以作为恶性胶质瘤潜在的药物靶点,Brd4选择性抑制剂JQ1可以有效的发挥治疗恶性脑胶质瘤的作用。