微拟球藻二十碳五烯酸EPA分离纯化及降血脂活性

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二十碳五烯酸EPA因具有抗炎、抗肿瘤及降血糖血脂等生物活性而备受关注。传统EPA来源于鱼油,但其存在提取复杂、季节限制以及重金属污染等弊端。海洋微藻因生长周期短、油脂含量高且无腥味和胆固醇成分等优势成为高品质EPA生产的理想原料。而高效且便捷的微藻EPA分离纯化策略是实现微藻EPA工业化的关键之一,因此本文以高产EPA海洋微拟球藻为研究对象,先建立微拟球藻脂质尼罗红染色荧光定量条件,再优化藻细胞内油脂的分离纯化条件,并探究EPA体外降血脂活性。取得的研究结果如下:1)以微拟球藻藻粉为受试对象,通过单因素结合响应面优化得到尼罗红染色微拟球藻脂质定量的最佳条件为:激发波长430 nm,发射波长685 nm,二甲基亚砜浓度25.6%,染色时间16 min,尼罗红终浓度0.11μg/m L。在最适发射波长和最佳染色条件下,尼罗红染色微拟球藻胞内脂质荧光强度与传统重量法测定油脂含量显著正相关(R~2=0.9999),表明通过尼罗红染色荧光法可快速表征微拟球藻胞内脂质含量,为规模化筛选高产油脂藻株及动态追踪微藻产油过程提供了依据。2)以上述方法测得的微拟球藻跑道池培养最佳时期收获的藻粉为原料,比较得到以30%盐酸结合80℃水浴法提取得到的微拟球藻油脂和EPA含量最高,分别为21.55%和19.11 mg/g藻粉。进一步优化该法提取条件,在料液比为5 wt%,萃取时间5 min,80℃水浴处理20 min下,微拟球藻油脂得率由21.55%提高至37.33%,EPA含量由19.11 mg/g提高至76.80 mg/g藻粉。在最佳尿素包合条件下(脂肪酸/尿素/无水乙醇(1:3:1,g/g/m L)、反应温度85℃、-20℃包合2 h),EPA纯度由24.74%提高至46.13%,EPA得率为70.92%,其藻油EPA含量高于大部分市售保健品EPA含量(<30%)。3)将2)中提纯EPA设置不同浓度梯度(0~500μg/m L),其对HepG-2细胞活力考察结果显示:不同浓度EPA对HepG-2细胞活力均无显著影响。选择5、100、500μg/m L EPA 3个实验浓度,探究其对高血脂及高胆固醇HepG-2细胞血脂水平影响,研究发现预防因子EPA以浓度依赖性方式显著降低高血脂HepG-2细胞中LDL-C、TC、TG水平,500μg/m L EPA使其含量分别降低了47.62%、50%、51.62%,而在高胆固醇HepG-2细胞中LDL-C、TC、TG含量分别降低了44.44%、56.67%、34.79%。此外,高血脂和高胆固醇HepG-2细胞中HDL-C含量均随着EPA浓度增加呈上升趋势,500μg/m L EPA使其含量分别增加了2.60倍和2.01倍。以上结果表明微拟球藻EPA作为预防因子在高血脂细胞中对HDL-C和LDL-C作用效果与非诺贝特基本一致,在高胆固醇细胞中对HDL-C、LDL-C和TC的作用效果与辛伐他汀相当,有望以预防或治疗因子辅助临床降血脂药物降低血脂水平。
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