【摘 要】
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姜黄（Curcuma longa L.）是姜科多年生草本植物,姜黄素类化合物是姜黄块茎的主要活性成分,具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗HIV等多种生物活性,但由于其水溶性差、提取率低、生物利用度低等缺点,极大地限制其在临床上的应用潜力。通过微生物转化法对姜黄素进行结构改造,可获得更高活性、应用范围广、商业价值高的姜黄素衍生物。本研究从姜黄块茎中分离内生真菌,筛选能够转化姜黄素生成姜黄素氢化衍生物的菌株,
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姜黄（Curcuma longa L.）是姜科多年生草本植物,姜黄素类化合物是姜黄块茎的主要活性成分,具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗HIV等多种生物活性,但由于其水溶性差、提取率低、生物利用度低等缺点,极大地限制其在临床上的应用潜力。通过微生物转化法对姜黄素进行结构改造,可获得更高活性、应用范围广、商业价值高的姜黄素衍生物。本研究从姜黄块茎中分离内生真菌,筛选能够转化姜黄素生成姜黄素氢化衍生物的菌株,然后分析转化姜黄素菌株的生物活性;通过优化其发酵培养基,提高姜黄素氢化衍生物含量;最后采用转录组测序技术挖掘差异表达基因,阐明姜黄素转化为姜黄素氢化衍生物的基因表达。本研究的主要结果如下:1.本研究从11个产地的姜黄块茎中分离出62株内生真菌。通过姜黄素选择培养基筛选具有转化姜黄素能力的菌株。结合TLC和HPLC的检测,共筛选出7株可以将姜黄素转化为四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的菌株。7株姜黄内生菌经ITS序列测序,5株菌属于镰刀菌属Fusarium sp.,2株菌分别属于棒孢菌属Corynespora和节菱孢属Arthrinium。从GD姜黄块茎中筛选出的菌株中有1株具有转化姜黄素为四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的特征,该菌株鉴定为Fusarium sp.GD1。2.GD1菌株的形态特征:菌丝乳白色至淡黄色,菌丝从中心向周围扩散数个放射性黄圈,菌落边缘规则,菌落背面为同心环状;小型分生孢子为卵型较多,少有肾形,多数无隔,少有1个隔膜;大型成熟分生孢子多呈镰刀型,有明显分隔,多为1～2个隔膜,少有3个。GD1菌株的生长周期12 d,生长过程包括适应期、快速生长期和衰亡期三个阶段。3.进行GD1菌株生物活性研究,发现GD1菌株具有APX、CAT、SOD、POD、Ca2+Mg2+-ATPase、PAL和PPO等活性,其中CAT和POD活性较高,分别达到223.74 U·g-1和1640.59 U·g-1;GD1菌液中IAA含量为5.251μg·m L-1,具有促生活性;GD1菌株A/Ar为0.48,属铁载体高产菌株;GD1菌株还具有一定的溶磷能力。4.开展GD1菌株抗氧化活性研究,试验表明GD1菌株菌液有效萃取剂为MAE和BAE,其最低浓度分别为0.5 mg·m L-1和0.6 mg·m L-1;GD1菌液ABTS自由基清除活性、DPPH自由基清除活性、Fe3+还原能力,分别达到92.15%、87.76%和Abs3.000;总多酚、总黄酮和总皂苷含量分别达到264.45 mg·L-1、157.62mg·L-1和4.78 mg·m L-1。GD1菌株对灰霉葡萄孢和香蕉枯萎病4号生理小种的抑菌率分别为77.44%和29.89%。5.进行GD1菌株的培养体系优化试验,分析GD1菌株的菌体生长量、HHC转化率和THC、OHC、HHC产量的变化,筛选出GD1菌株最佳培养基组分为:30 g葡萄糖、1 g尿素、1 g KH2PO4、0.5 g KCl、0.4 g Mg SO4·7H2O、0.01 g Fe SO4、最适p H值为7.0;在此条件下添加姜黄素进行微生物转化,菌液中四氢姜黄素和六氢姜黄素分别提高8.20%和44.31%。6.基于转录组测序技术,分析GD1菌株转化姜黄素的不同培养时间样本,共获得15846个Unigenes,优化评估组装结果得到16008个Unigenes。试验表明GD1菌株转化姜黄素96 h与对照处理间有1786个差异表达基因Unigenes,其中表达量上调有1441个Unigenes,表达量下调有345个Unigenes。通过GO注释表明主要涉及酶催化活性、氧化还原酶活性和有机氮化合物代谢等过程。筛选出与羰基还原酶、短链脱氢酶、烯醇-COA还原酶和NADPH依赖性黄素氧化还原酶等酶家族相关的5个基因,RT-q PCR验证结果与转录组测序结果基本吻合。
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