论文部分内容阅读
Wnt/β-catenin信号通路在生物体进化过程中高度保守,通过对细胞增殖、分化、极化等细胞命运的直接调控,控制着胚胎发育、组织和器官形成等生命活动过程中的重要事件。近年来,越来越多的研究显示Wnt信号通路与多种恶性肿瘤尤其是结肠癌的发生发展的密切关系,使其成为肿瘤生物学以及癌症治疗的研究热点,靶向Wnt信号通路的抗肿瘤药物研究引起了广泛的关注。天然化合物结构新颖多样,毒性较低,是抗肿瘤药物研究开发的重要来源,本文依托植物化学及西部植物资源持续利用国家重点实验室的天然产物研究优势,从结构多样的天然化合物中筛选Wnt信号的小分子抑制剂,对其进行抗肿瘤活性及作用机制的研究,研究结果不仅为研发具有新颖作用机制的抗肿瘤药物奠定重要的药理学基础,对阐明Wnt信号通路调控新机制,发现新的肿瘤药物靶点也具有重要的意义。
第一部分:构建Wnt信号持续激活稳定转染细胞株模型以及天然小分子抑制剂的筛选。研究通过稳定转染Wnt3A基因激活Wnt信号通路,同时共转染并表达特异响应Wnt信号的萤火虫荧光素酶Topflash以及作为内参的海肾荧光素酶Renilla报告基因系统,并进行抗性筛选。共筛选获得6个带有抗性标记的单克隆细胞株,通过检测所获得的6个单克隆细胞株中的Wnt信号水平,最终确定了高水平激活Wnt信号并且状态稳定的细胞株HEK293W。在对稳定细胞株模型用于筛选检测的可行性分析中,HEK293W对Wnt信号通路抑制剂表没食子儿茶素(EGCG)和激活剂氯化锂(LiCl)的作用都显示了很好的敏感性。应用构建的稳定表达Wnt信号筛选模型对近4000个天然小分子进行了抑制活性筛选,获得约20个具有初步活性的分子。
第二部分:对筛选获得的2个小分子Wnt信号抑制剂(Henryin和Z86)进行抗肿瘤活性及作用机制的研究。Henryin是从唇形科香茶菜属植物Isodon rubescens var.lushanensis中分离纯化得到的对映-贝壳杉烷型二萜化合物。很多香茶菜属植物在民间被用于预防和治疗炎症、胃肠道感染以及癌症等疾病。很多从香茶菜属植物中分离纯化的天然化合物也具有明显的抗肿瘤活性。Henryin是从该属化学成分中筛选获得的具有抑制结肠癌细胞增殖的小分子。进一步的Wnt信号通路抑制剂筛选以及基因芯片研究揭示Henryin特异抑制Wnt信号通路,初步揭示了Henryin选择性抑制结肠癌细胞增殖的作用机制。进一步的研究表明Henryin作用于Wnt信号通路下游的转录复合体,通过抑制结肠癌细胞中的β-catenin/TCF-4转录复合物的结合而下调Wnt靶基因的表达,将细胞周期阻滞在Gl/S期,从而抑制结肠癌细胞增殖。
本研究表明Z86是筛选获得的另一个显著抑制Wnt信号的化合物,该化合物作用于Wnt信号通路上游的β-catenin降解复合物,促进β-catenin蛋白的磷酸化及泛素化降解,从而抑制Wnt信号通路,Z86对体外结肠癌细胞具有选择性的增殖抑制作用,裸鼠移植瘤实验结果显示Z86能够有效抑制体内结肠肿瘤的生长。药物筛选是发现新药的主要手段和方法,通过筛选而获得具有生物活性的先导化合物是创新药物研究的关键。本研究建立了Wnt信号稳定表达的细胞筛选模型,有效提高了Wnt信号抑制剂的筛选效率,同时也为天然化合物的活性研究提供快速有效的研究模型。研究首次发现对映-贝壳杉烷型二萜化合物通过抑制Wnt信号通路在结肠癌中发挥抗肿瘤的作用机制。我们的研究结果不仅丰富了对Wnt信号途径具有抑制活性的天然产物的结构类型,而且对该类二萜化合物的生物活性研究提供了新的思路和方法,并为对映-贝壳杉烷型二萜化合物的抗肿瘤药物开发提供了阐明作用机制的药理学支持。小分子Z86选择性地抑制体内外结肠肿瘤增殖以及获得的系列重要药理学数据为该化合物后续的抗肿瘤药物研究开发提供了重要的基础。