Nimble Cloning是一项新型的分子克隆技术,具有操作简单、使用灵活、克隆效率高、标准化克隆等优点。但Nimble Cloning需要使用配套的表达载体。本研究对pDOE系列的植物BiFC表达载体进行改造,去除其内在的SfiI位点,在载体内插入NC克隆框,构建了一套适用于Nimble Cloning的植物BiFC表达载体,并将它们应用于蛋白互作研究。pDOE系列BiFC载体使用pCambia载体框架,将其改造为Nimble Cloning系统载体需要先去除其内在SfiI位点。本研究采用突变碱基的方式成功去除pCambia载体中的5个SfiI位点,并且对改造后的载体在农杆菌中的稳定性以及在植物中的表达进行分析。结果表明突变pCambia载体的5个SfiI位点突变对载体的稳定性和表达情况没有影响,突变后的载体框架适合用于构建Nimble Cloning系统载体。利用含5个SfiI位点突变的片段,通过Nimble Cloning反应介导的片段置换,将pDOE系列的4个整合型BiFC载体上的SfiI位点去除。接着在这4个载体的多克隆位点处插入NC克隆框,从而构建了以pCambia为框架的一系列整合型BiFC表达载体,命名为pNC-BiFC-VD系列载体。在整合型载体的基础上,采用酶切、接连的方法去除一个荧光蛋白片段表达框,构建了一系列传统型单克隆框的BiFC表达载体,命名为pNC-BiFC-V系列载体。为了该套BiFC载体的广泛使用,本研究还将pCambia框架的pNC-BiFC系列载体的框架替换成pGreen框架,构建了以pGreen为框架的一系列(8个)BiFC表达载体。利用构建好的pNC-BiFC-V系列载体,对两对蛋白的互作进行了研究。该两对蛋白为互作发生在细胞核的番木瓜eIFiso4E和PRSV-vpg,以及在细胞质发生自身互作的PLDMV-HCPro。使用Nimble Cloning技术将这些蛋白的基因克隆到pNC-BiFC-V系列载体,通过农杆菌转化烟草瞬时表达,利用激光共聚焦显微镜观察各个目标载体的荧光表达情况。结果表明,注射含番木瓜eIFiso4E和PRSV-vpg基因的烟草叶片均在细胞核检测到荧光,而注射含PLDMV-HCPro基因的烟草叶片在细胞质检测到不同程度的荧光。本研究构建的Nimble Cloning系统植物BiFC载体操作简单、使用方便,有望在植物蛋白互作中得到广泛应用。同时,该套载体也将丰富Nimble Cloning系统的配套载体,促进Nimble Cloning技术的推广应用。