紫薯蛋白花色苷复合物的结构表征及生物活性研究

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紫薯是我国甘薯资源中一种特殊的品种,富含花色苷和蛋白质等活性成分。花色苷类化合物对蛋白质有极高的亲和性,花色苷通过共价键或非共价键的形式与蛋白质结合形成复合物。本研究以鄂薯12号为原料,以乙醇为溶剂超声辅助提取制备紫薯花色苷粗取物(PSPA-E),以纯水为溶剂超声辅助提取结合硫酸铵沉淀及膜过滤制备紫薯蛋白花色苷复合物粗提物(PSPAP-E),经DEAE-52阴离子交换层析柱和Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱纯化紫薯蛋白;高效液相色谱-二极管阵列检测-串联离子阱多级质谱(HPLC-DAD-EI-MS/MS)法对花色苷结构进行分析鉴定,三重四级杆飞行时间质谱(Triple-TOF-MS)对紫薯蛋白进行肽质量指纹图谱鉴定。探讨了紫薯花色苷在加热和贮藏过程中的降解规律和聚合物颜色变化特征;评价了PSPAP-E对LPS诱导的巨噬细胞(RAW264.7)中炎症介质和转录因子的调控作用,以及对STZ诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用,主要结论如下:1.通过HPLC-DAD-ESI-MS/MS对花色苷结构进行分析鉴定,PSPA-E中鉴定出13种主要的花色苷,PSPFA-E中仅含有其中的3种,表明PSPAP-E中含有丰富的花色苷;SDS-PAGE分析显示,紫薯蛋白主要有58、22、18和12 kDa四个染色带,通过Triple-TOF-MS对紫薯蛋白酶解后的肽段鉴定出17种蛋白质,其主要包括一些具有生物活性的酶类和Sporamin蛋白。2.PSPA-E在4、20和35℃贮藏期间,总花色苷和各单体花色苷含量逐渐下降,降解符合一级动力学模型特征;4、20和35℃贮藏条件下总花色苷半衰期分别为228.8、48.1和32.6天;单体花色苷的降解规律为:糖苷相同的情况下,矢车菊素的半衰期要低于芍药素,酰基化花色苷的半衰期要高于未酰基化花色苷;花色苷褐变指数和聚合物颜色指数随贮藏时间的增加和贮藏温度的升高而增大,聚合物颜色指数与花色苷含量之间呈指数关系;模型体系的颜色变化差异不明显。3.pH值为3.0、5.0和7.0的PSPA-E在90℃热处理过程期间,总花色苷和各单体花色苷的降解符合一级动力学模型特征,花色苷的半衰期分别为9.7、12.4和4.7小时;聚合物颜色形成遵循零级动力学,且聚合物指数随pH值增大逐渐增加,聚合物颜色形成的反应速率常数分别为0.0150、0.0155和0.0284 h-1;CIELAB系统评估花色苷提取物的颜色变化结果表明L*,a*,b*和ΔE在热处理期间随着时间和pH值显著改变(p<0.05),花色苷的降解的同时并伴随着缩合反应导致明显的颜色变化。4.在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中研究了PSPAP-E和PSPFA-E的抗炎症活性和潜在机制。结果表明:PSPAP-E和PSPFA-E预处理细胞可显著降低NO、TNF-α和ROS水平,并显著抑制iNOS和TNF-α的mRNA表达。同时,诱导Nrf2和HO-1的mRNA表达。此外,PSPFA-E和PSPAP-E均可在一定程度上降低JNK、p38、NF-κB和AP-1的相对表达量,两者之间没有显著差异,结果表明PSPAP-E和PSPFA-E对LPS诱导的炎症有预防作用。5.在高脂饲料喂养的同时腹腔注射STZ建立Ⅱ型糖尿病模型,研究了PSPA-E和PSPAP-E的降血糖活性。结果表明:PSPA-E和PSPAP-E饲喂糖尿病小鼠12周能够显著降低小鼠的空腹血糖值,提高其口服糖耐量,显著升高血清胰岛素、降低胰高血糖素。此外,PSPA-E和PSPAP-E显著降低糖尿病小鼠的血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平(p<0.05),提高血清高密度脂蛋白水平和AST/ALT比值。对各组小鼠肝脏中的MDA、Cu-Zn SOD、T-AOC和GSH-Px四个抗氧化指标的测定结果进行比较发现,PSPA-E和PSPAP-E降低了小鼠肝脏MDA含量,一定程度提高了Cu-Zn SOD和T-AOC活力、GSH-Px含量;PSPA-E和PSPAP-E对STZ诱导的糖尿病导致的肝脏损害有一定的修复作用。
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