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第一部分:IL-34对Kupffer细胞极化的影响目的:探讨IL-34在体外试验中对Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)极化的影响。方法:利用经本课题组改良后的差速离心法分离大鼠KCs;流式细胞术检测提取的KCs的纯度;吞墨试验检测KCs的吞噬功能。用LPS及不同浓度的大鼠IL-34重组蛋白依次处理KCs;RT-PCR、ELISA检测IL-10、TGF-β及IL-12的表达水平;western blot检测Arg-1的表达水平。结果:(1)利用改良后的差速离心法提取的KCs纯度高于90%;(2)KCs经LPS处理后,其IL-12的表达水平显著升高;(3)在LPS处理的基础上用大鼠IL-34重组蛋白处理KCs后,其IL-12表达水平下调,IL-10、TGF-β及Arg-1表达水平上调;(4)单独使用大鼠IL-34重组蛋白处理对KCs中IL-10、TGF-β及IL-12的表达影响不明显。结论:IL-34能在体外实验中诱导KCs M2极化。第二部分:IL-34诱导Kupffer细胞M2极化的分子机制目的:在体外实验中探讨IL-34诱导KCs M2极化的分子机制。方法:将分离的KCs随机分为以下四组:(1)对照组:KCs培养于普通培养基内;(2)LPS 组:LPS(100ng/ml)处理 KCs;(3)IL-34组:LPS及大鼠IL-34重组蛋白(5ug/ml)依次处理KCs;(4)LY294002组:用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(40μM)预处理KCs,再用LPS及大鼠IL-34重组蛋白依次处理KCs;(5)Rapamycin组:用mTOR信号通路抑制剂Rapamycin(10nM)预处理KCs,再用LPS及大鼠IL-34重组蛋白依次处理KCs。Western blot检测KCs中Akt1/2、Akt1、Akt2、mTOR、4E-BP、S6K、p38MAPK 及 p65 的磷酸化水平、IκB及Arg-1的表达水平,RT-PCR、ELISA分别检测IL-10、TGF-p及IL-12在培养上清中的浓度及mRNA水平的表达情况,流式细胞术检测M2型KCs的百分比。结果:(1)LPS组Akt1/2的磷酸化水平高于对照组,IL-34组Akt1/2及Aktl的磷酸化水平高于LPS组及LY294002组;IL-34组Akt2的磷酸化与LPS组及LY294002组差别不明显;LPS组IL-12的表达高于对照组,IL-34组IL-12的表达水平低于LPS组及LY094002组,IL-34组IL-10、TGF-β及Arg-1的表达水平高于LPS组及LY094002组,IL-34组M2型KCs的百分比高于LPS组及LY094002组;(2)IL-34组mTOR、S6K及4E-BP磷酸化水平高于LPS组及LY294002组,IL-34组IL-12表达水平低于 LPS 组及 Rapamycin 组,IL-34 组 IL-10、TGF-β及 Arg-1表达水平高于LPS组及Rapamycin组,IL-34组M2型KCs的百分比也高于LPS组及IL-34组;(3)LPS组p38 MAPK及p65磷酸化水平高于对照组,IL-34组p38 MAPK及p65磷酸化水平低于LPS组及LY094002组,LPS组IκB-α表达水平低于对照组,IL-34组IκB-α表达水平高于LPS组及LY094002组。结论:(1)IL-34通过激活PI3K/Akt通路诱导KCsM2极化;(2)PI3K/Akt信号通路下游mTOR信号通路的激活参与了 IL-34诱导的KCs M2极化的过程;(3)PI3K/Akt下游的NF-κB及p38MAPK信号通路的抑制可能参与了 IL-34诱导的KCs M2极化的过程。第三部分:IL-34通过诱导Kupffer细胞M2极化抑制大鼠肝移植急性排斥反应目的:(1)探讨过表达受体IL-34对大鼠肝移植急性排斥反应(Acute Rejection,AR)的影响;(2)探讨IL-34对大鼠肝移植AR的影响是否由KCs M2极化所介导。方法:此部分研究分为两部分动物实验,采用双袖套法建立LEW-BN肝移植AR模型(LEW大鼠为供体,BN大鼠为受体)。第一部分动物实验分组如下:(1)对照组:BN大鼠于肝移植术前1月注射生理盐水;(2)AAV-GFP组:BN大鼠于肝移植术前1月注射表达绿色荧光蛋白的腺相关病毒;(3)AAV-IL-34组:BN大鼠于肝移植术前1月注射过表达IL-34的腺相关病毒。术后观察各组受体大鼠的生存率,术后第7天肝组织HE染色并根据Banff评分标准计算排斥活动指数(RAI);分别检测术前1天、术后第1、3、5、7天血清ALT、AST及TBIL的水平;ELISA检测术后第7天血清中IL-10及IFN-γ水平;westemblot检测术后第7天供肝KCs中Arg-1的表达水平;RT-PCR检测术后第7天供肝KCs中IL-10、IL-12及TGF-β的表达水平。第二部分动物实验分组如下:(1)对照组:BN大鼠于肝移植术前1月注射生理盐水;(2)AAV-IL-34组:BN大鼠于肝移植术前1月注射过表达IL-34的腺相关病毒;(3)AAV-IL-34+clodronate组:LEW大鼠术前用氯膦酸盐去除体内的KCs;(4)AAV-IL-34 +clodronate+KCs回输组:LEW大鼠术前用氯膦酸盐去除体内的KCs,在肝移植手术过程中将未处理的KCs经门静脉输入供肝内;(5)AAV-IL-34+clodronate+LPS处理KCs回输组:LEW大鼠术前用氯膦酸盐去除体内的KCs,在肝移植手术过程中将LPS处理的KCs经门静脉输入供肝内。术后观察各组受体大鼠的生存率;术后第7天获取供肝组织行HE染色并根据Banff评分标准计算RAI;术后第7天检测血清ALT、AST及TBIL水平。结果:第一部分动物实验:(1)AAV-IL-34组中大鼠的生存时间长于对照组及AAV-GFP组,AAV-IL-34组RAI低于对照组及AAV-GFP组,术后第7天AAV-IL-34组中大鼠血清IL-10的浓度较对照组及AAV-GFP组高,而IFN-γ的浓度较低,AAV-IL-34组术后血清ALT、AST及TBIL水平较对照组及AAV-GFP组低;(2)相对于对照组及AAV-GFP组,AAV-IL-34组的供肝KCs中IL-12表达较低,Arg-1、IL-10及TGF-β表达较高;(3)AAV-IL-34+clodronate组大鼠的生存时间短于 AAV-IL-34 组、AAV-IL-34+ clodronate+KCs 回输组及 AAV-IL-34+clodronate+LPS 处理 KCs 回输组,AAV-IL-34+clodronate 组移植肝组织损伤较 AAV-IL-34 组、AAV-IL-34+clodronate+KCs 回输组及AAV-IL-34+clodronate+LPS 处理 KCs 回输组明显,AAV-IL-34+clodronate 组 RAI 高于 AAV-IL-34 组、AAV-IL-34+clodronate+KCs 回输组及 AAV-IL-34+clodronate+LPS 处理 KCs 回输组,AAV-IL-34+clodronate组术后第7天的血清ALT、AST及TBIL水平明显高于AAV-IL-34 组、AAV-IL-34+clodronate+KCs 回输组及 AAV-IL-34+clodronate+LPS 处理 KCs 回输组;而 AAV-IL-34+clodronate+KCs 回输组及AAV-IL-34+ clodronate+LPS处理KCs回输组AR的程度差别不大。结论:(1)过表达受体大鼠IL-34能抑制大鼠肝移植AR;(2)IL-34能诱导肝移植术后供肝内KCs M2极化;(3)KCs的M2极化介导了IL-34对大鼠肝移植AR的抑制效应。