目的:随着环境污染日益增多,大气臭氧层日见稀薄,紫外线照射强度增大,黄褐斑、雀斑等皮肤问题严重影响人们的生活质量,因此具有美白功效的护肤品受到了许多人的追捧。近年来已有研究学者对葛根黄酮和异黄酮抑制酪氨酸酶活性做了报道,但是对葛根水溶性总蛋白美白活性研究尚未报道,因此我们通过前期筛选确定了葛根水溶性总蛋白为美白的活性成分,并利用响应面BBD设计试验获得最佳葛根蛋白提取工艺,在此基础上对其进行理化性质研究和其对小鼠黑色素瘤B16细胞的影响及作用机制研究。方法:1.经筛选确定美白活性成分,进行提取时间、料液比、p H的单因素试验,确定响应面三因素水平,按照BBD设计进行工艺优化。2.通过葛根水溶性总蛋白结构、理化性质和功能特性研究:采用UV、FTIR、CD和荧光光谱等光谱方法分析葛根水溶性总蛋白的结构组成,检测葛根蛋白的蛋白分子量、氨基酸组成、溶解度、乳化性、持油性和持水性等理化性质和功能特性。3.采用MTT法观察葛根水溶性总蛋白对B16细胞增殖的抑制作用,多巴氧化法测定给药前后细胞内酪氨酸酶活性的变化,Na OH裂解法测定细胞中黑色素含量的变化,流式细胞仪检测葛根水溶性总蛋白对B16细胞线粒体膜电位、细胞凋亡细胞周期的影响,采用Western blot检测葛根水溶性总蛋白对B16细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9的表达变化以及与黑色素形成的相关蛋白TYR、TRP-1、TRP-2、MITF和p38的表达变化,同时用q RT-PCR法来观察黑色素相关因子基因表达的影响。采用酶联免疫吸附法检测氧化应激相关因子的变化,采用Seahorse对线粒体氧化磷酸化的测定。结果:1.通过体外抑制酪氨酸酶活性实验来筛选出最终有效成分为葛根饮片提取的水溶性总蛋白,优化提取工艺确定为提取时间4 h,料液比1:10,p H8,此最佳提取工艺可使蛋白收率达到1.6%左右。2.PLP的二级结构主要由β-折叠、β-转角和无规卷曲构成,红外图谱结果显示PLP具有CO、-NH、COO-等特征性官能团。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明,PLP主要由分子量小于62 k Da的蛋白质组成;在等电点附近,PLP的溶解度、乳化活性和乳化稳定性先减小后增大;其持水性为0.8 g/g,持油性值为2.94 g/g。3.葛根水溶性总蛋白可以抑制酪氨酸酶活性,减少黑色素的生成,降低细胞氧化应激水平。MITF（小眼畸形相关转录因子）为贯穿本章节的关键因子。p38MAPK通路可以激活MITF。p38表达的降低使MITF表达量降低,MITF表达下调能抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖、降低TYR、TRP-1和TRP-2的表达,且TRP-1和TRP-2参与了TYR下游的黑色素合成,因此TRP-1、TRP-2表达的减少下调了TYR的表达,从而减少黑色素的合成。随后,MITF表达的降低还可以促进细胞凋亡,从而上调Bax/Bcl-2的比值,并上调caspase-3和caspase-9的表达从而促进细胞凋亡。细胞凋亡不仅降低了细胞的ATP释放和线粒体质量,还抑制了细胞的氧化磷酸化水平。结论:经过响应面法优化后的葛根水溶性总蛋白提取工艺,其具有蛋白所含有的理化性质,并且可以抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖,其作用机制是通过促进细胞凋亡和抑制黑色素形成。