嗜麦芽窄食单胞菌临床株的耐药现状及分子耐药机制研究

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【目的】 了解广东省湛江、深圳两地区嗜麦芽窄食单胞菌的耐药现状和耐药水平;掌握嗜麦芽窄食单胞菌产β-内酰胺酶的种类和水平及其与耐药性的关系;证实嗜麦芽窄食单胞菌流行株耐药性与外膜蛋白的相关性;分析主动外排系统与嗜麦芽窄食单胞菌耐药的相关性;用PCR扩增耐药基因(qacE△1-sul Ⅰ、int Ⅰ1)并对其进行定位,以分析其与耐药的相关性,为临床治疗嗜麦芽窄食单胞菌感染合理应用抗生素及流行病学研究提供依据和指导。 【方法】 1对临床标本中分离的55株嗜麦芽窄食单胞菌进行系统鉴定。 2 对嗜麦芽窄食单胞菌进行抗生素敏感性试验: 2.1 采用纸片扩散法(K-B法)测定嗜麦芽窄食单胞菌对21种抗生素的敏感性; 2.2 采用琼脂稀释法测定嗜麦芽窄食单胞菌对6种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。 3 嗜麦芽窄食单胞菌β-内酰胺酶的分析: 3.1 表型确证实验纸片法进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的测定; 3.2 亚胺培南-EDTA 纸片增效法检测金属β-内酰胺酶。 4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对外膜蛋白(OMP)进行分离、鉴定。 5 检测泵抑制剂(CCCP)对嗜麦芽窄食单胞菌氟喹诺酮类敏感性的影响。 6 碱裂解法抽提嗜麦芽窄食单胞菌的质粒,PCR 扩增嗜麦芽窄食单胞菌耐药基因(qacE△1-sul Ⅰ、int Ⅰ1)并对其进行定位分析。 【结果】 155株嗜麦芽窄食单胞菌在各临床标本中的分布分别为痰和气管吸出物45株占81.82%,尿液5株占9.09%,血液3株占5.45%,胸水和胆汁各1株占1.82%。感染人群主要以60岁以上年龄段为主,占74.5%(41/55)。ICU、呼吸内科的分离率分别为30%、22%。 2 嗜麦芽窄食单胞菌对21种抗生素的药敏结果显示:对头孢唑林、头孢西丁全部耐药。对头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南、氨苄西林/舒巴坦、红霉素、氨曲南、头孢吡肟、四环素的耐药情况十分严重,耐药率分别为 98.18%、98.18%、96.36%、94.55%、94.55%、90.91%、87.27%、74.55%。而对米诺环素、左氧氟沙星、复方新诺明、环丙沙星、替卡西林/克拉维酸表现为较高的敏感性,其敏感率分别为94.55%、92.73%、87.27%、69.09%、67.27%。对10种以上抗菌药物耐药的临床株共51株,占总分离数的92.73%,其中多重耐药株大部分为同时对10-15种抗菌药物耐药的菌株。 3 琼脂稀释法测定对6种抗菌药物的耐药率均高于K-B 法,两种方法对庆大霉素的耐药率测定结果差别有统计学意义(P<0.001),而对另外5种抗菌药物的耐药率差别无统计学意义(P>0.05)。 4 嗜麦芽窄食单胞菌的ESBLs阳性率为34.55%(19/55),金属B-内酰胺酶阳性率达96.36%(53/55)。ESBLs阳性菌株与ESBLs阴性菌株对哌拉西林等19种抗菌药物的耐药程度差别无统计学意义(P>0.05)。 5 深圳、湛江两地区的嗜麦芽窄食单胞菌临床株对哌拉西林等21种抗菌药物的敏感性差别无统计学意义(P>0.05)。 6 SDS-PAGE 检测嗜麦芽窄食单胞菌的主要外膜蛋白都有9条左右,对四环素敏感的菌株,其外膜蛋白均出现相对分子质量约20 000的条带减弱。 7 55株嗜麦芽窄食单胞菌共筛选出9株外排泵阳性菌,CCCP 在体外能增强FQS抗菌活性,主动外排机制既存在于FQS耐药株,也存在于FQS 敏感株,对耐药株影响更大。 8 嗜麦芽窄食单胞菌质粒携带率为7.27%(4/55)。以55株细菌总DNA为模板,intⅠ1 基因阳性率为9.09%(5/55),qacE△1-sul Ⅰ基因阳性率为7.27%(4/55);以提取的质粒为模板,4株携带质粒的临床株中检出int Ⅰ1、qacE△l-sulⅠ基因阳性株各为1株。 【结论】 1嗜麦芽窄食单胞菌引起的感染以呼吸道为主,感染人群以老年人多见。 2 抗生素敏感性试验结果显示:湛江深圳两地嗜麦芽窄食单胞菌的耐药现状十分严重,多重高度耐药株广泛分布。 3 产生金属β-内酰胺酶是嗜麦芽窄食单胞菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。 4 嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白的缺失、表达减弱或增强与细菌耐药有一定的相关性。 5 嗜麦芽窄食单胞菌对氟喹诺酮类耐药与主动外排泵有关,泵抑制剂CCCP可部分逆转这种耐药性。 6 Ⅰ类整合子的存在和qacE△l-sulⅠ基因的表达参与嗜麦芽窄食单胞菌磺胺类药物耐药,与磺胺类药物高度耐药性产生有关。 7 嗜麦芽窄食单胞菌的耐药基因主要位于染色体上,但少数质粒上携带Ⅰ类整合子引起的耐药性传播可能将使磺胺类药物的应用受到一定限制。 8 亚胺培南-EDTA 纸片增效法是一种简便、经济、可靠的金属β-内酰胺酶筛选方法。
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