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芋螺毒素(Conotoxin,CTX)是一类由热带海洋肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌出来的,由8~41个氨基酸残基组成的小分子多肽,富含二硫键。芋螺毒素的化学结构新颖,生物活性强,作用靶位选择性高,已成为药理学和神经科学的有力工具和药物开发的新来源,是全世界海洋药物研究的热点之一。已经成功研究的芋螺毒素大多属于A—超家族,O—超家族和M—超家族等,如MVIIA,SO3等。而对T—超家族芋螺毒素的研究,则鲜见报道。T—超家族芋螺毒素作为芋螺毒素资源的一大成员,广泛存在于各种芋螺中,具有巨大的药物开发和研究潜力。
本研究从海南产的织锦芋螺(C.textile)毒管中提取总RNA后,再反转录为cDNA,以之为模板,利用RT—PCR法分离克隆到一个新型T—超家族芋螺毒素的cDNA,全长389bp,命名为TeA31N:该cDNA编码的毒素肽前体命名为TeA31P,已在GenBank中登录,序列号为DQ141136。根据TEA31 N的核苷酸序列,推测出其前体序列TeA31P由61氨基酸残基组成:MPCLPVFVILLLL IASVPSDAQL KTKDDMPLPSFNGN ARRTPRMLSNKRICCYPNVWCCD。该序列包括芋螺毒素前体典型的三个区域:长度为24个氨基酸的信号肽(上述序列中的灰色背景部分);长度为26个氨基酸的前肽,以及长度为11个氨基酸的成熟肽。在前肽与成熟肽之间带有标准的蛋白酶水解位点(—XKR),据此推测出其成熟肽TeA31序列为:ICCYPNVWCCD(11AA)。
本实验用ABI公司433A型全自动多肽合成仪进行固相人工合成,并用Fmoc法成功合成了TeA31线性肽,经HPLC分离与质谱鉴定,TEA31的实际分子量为1317.42,与理论值1317.47相符。经质谱鉴定确证后的TeA31合成肽,再用HPLC进行分离纯化,获得的纯化TeA31肽在合适的条件下进行氧化折叠,折叠产物经HPLC纯化后用质谱鉴定分子量为1313.8,与氧化肽的理论分子量1313.47相符。至此,本研究从海南产织锦芋螺毒液中成功克隆到了一个新型T—超家族芋螺毒素TEA31的全长cDNA,及其人工合成肽,为后续的生物活性研究与结构鉴定提供了材料。同时,建立了一套较为完善的芋螺毒素基因克隆,人工合成与合成肽分离纯化和氧化折叠的实验技术与方法。可为新型海洋药物——海南产芋螺毒素的研究与开发提供基础。