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荞麦为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill)的非禾谷类粮食作物,主要栽培种有苦荞(F.tartaricum Gaerth)和甜荞(F.esculentum Moench)。荞麦因其生育期短、抗旱性强和对环境适应性好等优点,成为我国西北和西部干旱、半干旱高海拔冷凉山地重要的粮食作物。因其种子富含赖氨酸、芦丁和抗氧化活性等物质,具有很高的营养与保健功效,市场前景广阔。开展对荞麦抗逆分子生物学研究,不仅有助于解析荞麦对环境协迫应答的分子机制,同时为高产、耐逆与适应性好的荞麦新品种选育与种质创新积累基因资源。本研究以耐旱性较强的甜荞品种‘西农9976’为试验材料,从DREB同源基因及其启动子的分离与功能鉴定入手,研究该基因参与调控甜荞抗旱与耐寒应答模式与生理功能,探讨该基因参与甜荞抗逆应答的分子机制。主要研究结果如下:(1)同源克隆结合RACE技术,从甜荞品种‘西农9976’中分离出1个DREB同源基因,命名为Fe DREB1。该基因序列全长为859 bp,编码1个由189个氨基酸残基组成的转录因子。序列分析表明,Fe DREB1蛋白具有植物DREB(A-1)亚家族转录因子特点,包括1个AP2/EREBP结构域、1个DSAWR基序、1个LWSY基序和核定位信号。酵母单杂技术分析显示,甜荞Fe DREB1蛋白与DRE/CRT顺式作用元件特异结合,并激活下游目标基因的表达。亚细胞定位研究结果表明,转化p BI221-Fe DREB1-GFP重组表达载体的洋葱表皮细胞中只有细胞核存在明显的GFP荧光信号,其它细胞部分没有荧光信号,表明Fe DREB1转录因子定位于细胞核中。这些结果充分证实Fe DREB1蛋白属于DREB(A-1)亚家族转录因子。(2)构建p BI121-Fe DREB1表达载体,经农杆菌GV3101介导,采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),通过PCR和实时荧光定量方法进行了分子检测,获得35S::Fe DREB1稳定表达的T3代转基因植株和含有p BI121空载体的T3代野生型。对T3代35S::Fe DREB1转基因拟南芥植株进行表型、抗冻性和抗旱性分析表明,35S::Fe DREB1的拟南芥植株出现了矮化和延迟开花性状,其抗旱性和抗冻性均得到明显的提高;喷施外源赤霉素GA3可以使拟南芥35S::Fe DREB1的株高和开花时间恢复为野生型,但其抗冻性依然显著高于野生型拟南芥;生理指标测定表明35S::Fe DREB1转基因拟南芥植株叶片的脯氨酸、可溶性糖含量明显高于野生型;在正常生长条件下,35S::Fe DREB1转基因拟南芥植株的相对电导率与野生型没有差异,而在冻害和干旱胁迫下,35S::Fe DREB1转基因拟南芥植株的相对电导率显著低于野生型。(3)种子萌发试验表明,拟南芥35S::Fe DREB1植株种子对外源ABA高度敏感。利用数字基因表达谱技术(DGE)比较了拟南芥35S::Fe DREB1植株与野生型植株叶片的基因差异表达情况,结果发现在35S::Fe DREB1拟南芥的ERD7、ERD10、COR47、COR414-TM1、LEA14、COR15A、RD29A、P5CS2、At GOLS3和COR15B等非ABA依赖途径基因显著上调;许多ABA依赖途径抗逆相关基因,如NCED3、AZF2、HAI2、RD29B、ATDI21、TIP、RD26、RAS1、PEN1和RAB18也明显上调,表明Fe DREB1基因可能同时参与ABA和非ABA依赖的抗逆信号转导途径。(4)实时荧光定量(q RT-PCR)分析表明,在正常生长条件下Fe DREB1基因不表达,但在低温、高温、干旱和ABA处理下诱导表达。在低温和干旱胁迫下,在植株的根和叶中表达量高,茎中表达量低。利用染色体步移技术(Genome walking),从甜荞品种‘西农9976’基因组中分离到Fe DREB1基因上游长度为1710 bp的启动子候选片段。在分析相关顺式作用元件的基础上,构建5′-Fe DREB1启动子缺失片段的GUS瞬时表达载体,转化烟草(Nicotina benthamiana)植株叶片,分别在低温与干旱条件下进行GUS诱导表达。通过组织化学染色和荧光定量法检测GUS表达活性。结果表明,甜荞Fe DREB1基因上游-1710 bp的启动子片段至少含8种直接与干旱、低温胁迫应答相关的顺式元件;甜荞Fe DREB1上游p CD1(–270 bp)区段可以在低温诱导下,大幅度激活GUS基因表达;Fe DREB1上游的p CD1(–270 bp)、p CD2(–530 bp)和p CD3(–904 bp)区段在干旱诱导下,均可少量激活GUS基因表达,而p CD4(–1278bp)区段在干旱诱导下,可大幅度提高GUS基因表达水平。