一、理论研究变态反应性结膜炎(allergic conjunctivitis, AC)是眼科常见病之一,主要属于肥大细胞和IgE介导的Ⅰ型超敏反应性疾病。临床上,本病多伴随过敏性鼻炎、过敏性哮喘等疾病发生。目前,AC治疗以局部用药为主,肥大细胞稳定剂和抗组胺药物,短期疗效较好,远期疗效欠佳。使用免疫抑制剂和激素类药物,可以迅速控制病情,但疗效有限,长期用药,可引起严重的并发症。由于该病发病率高、病程长、易反复发作、疗效有限,已属眼科难治性疾病之一。眼是全身器官之一,眼局部参与系统超敏反应。动物模型证实鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)诱导的系统超敏反应可出现眼部过敏症状。AC主要属Ⅰ型超敏反应,且AC患者多伴有过敏性鼻炎、过敏性哮喘等系统反应。说明AC属系统反应在眼部的表现,治疗应从整体出发。川椒方是全国名老中医高健生研究员治疗AC的经验方,他在中医哲学思想指导下,根据中医理论,结合近十年的临床探索,并有所发展,认为AC的病机为“寒热相搏”,在此基础上形成了川椒方。川椒方由蛇床子、防风、荆芥、知母、地肤子、川椒、川芎等组成。课题组前期临床证实,川椒方能明显缓解眼痒、减轻结膜充血,且疗效明显优于肥大细胞(mast cell, MC)稳定剂色甘酸钠滴眼液和既能稳定肥大细胞又能抗组胺的奥洛他定滴眼液。又因川椒方为口服给药,还可以缓解过敏性鼻炎症状。同时,动物实验也证实川椒方可以减轻OVA诱导的小鼠AC急性期症状,降低小鼠血清IgG1, IgE, IL-4水平,减少结膜内嗜酸性粒细胞和中性粒细胞趋化聚集,以及肥大细胞数量,抑制其脱颗粒。说明川椒方可以稳定MC,抑制其脱颗粒。围绕“治疗和防止AC复发”这两大目标,本研究旨在探讨川椒方对MC的影响及作用机制,为临床推广奠定实验基础,同时为“寒热相搏”这一理论提供实验佐证。二、实验研究1目的在前期研究证实川椒方能有效治疗AC的基础上,围绕川椒方具有“稳定肥大细胞、抑制其脱颗粒”的作用,通过不同层次的功能和机制研究,观察川椒方对MC脱颗粒过程的影响,并探讨川椒方“稳定肥大细胞、抑制其脱颗粒”的作用机制。2方法(1)将84只Balb/c小鼠随机分为7组,即正常组、模型组(不给药)、阴性对照组(给予生理盐水灌胃)、川椒方水煎剂低中高剂量组(分别给予川椒方5.25,10.5,21.0g·kg-1灌胃,每天1次,灌胃体积均为10mL·kg-1)、奥洛他定滴眼液(0.1%)治疗组,每组各12只。用鸡卵清白蛋白免疫小鼠建立变应性结膜炎模型。裂隙灯观察小鼠急性期症状变化；甲苯胺蓝染色,计算结膜组织中MC数量及脱颗粒率；ELISA检测小鼠血清中前列腺素D2(PGD2)、P物质(SP)、组胺(HIS)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平；免疫组化检测结膜组织中SP表达；RT-PCR检测结膜组织中白介素(IL-4)和TNF-α的表达。(2)分别给予含川椒方生药6.68,13.36,26.71g·kg-1的水煎剂,灌胃体积均为20mL·kg-1,每日2次,连续给药3d。空白血清组给予等量的0.9%氯化钠溶液。制备SD大鼠含药血清,HPLC鉴定川椒方含药血清中是否存有川椒方君药蛇床子主要成分蛇床子素；MTT法检测各含药血清组对RBL-2H3细胞的最佳作用浓度。(3)采用anti-DNP IgE抗体联合DNP-BSA抗原刺激RBL-2H3细胞,复制细胞脱颗粒模型。利用酶底物法检测β-基己糖苷酶释放量。通过β-氨基己糖苷酶释放量,确定最佳抗体浓度、抗原作用时间以及含药血清最佳作用时间。(4)建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型。采用甲苯胺蓝染色法,观察RBL-2H3细胞脱颗粒数量和脱颗粒率；ELISA检测β-氨基己糖苷酶释放率,检测RBL-2H3细胞分泌IL-4和TNF-α的情况；运用real time-PCR检测IL-4和TNF-a mRNA表达水平；运用western blot技术,检测MC脱颗粒过程中重要蛋白p-AKT,p-ERK,p-p38,p-JNK水平。3结果(1)与正常组相比,模型组和阴性对照组临床症状评分显著升高(P<0.01),结膜肥大细胞聚集,脱颗粒明显(P<0.01)；血清中SP、PGD2、HIS和TNF-α的表达升高(P<0.01),结膜组织中SP, IL-4和TNF-α的表达升高(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组症状评分显著降低(P<0.01),各治疗组疗效相当(P>0.05)。结膜组织中肥大细胞数量减少,脱颗粒率下降(P<0.01)；血清中SP, PGD2, HIS和TNF-a的表达显著降低(P<0.01)；结膜组织中SP,IL-4和TNF-α的表达明显降低(P<0.01)。各治疗组疗效相当(P>0.05),均表现出较强的改善临床症状体征的作用。(2)HPLC结果显示蛇床子素标准品溶液与川椒方含药血清溶液保留时间在6.15-6.55min之间。空白血清溶液在此时间段内无明显吸收峰；MTT法提示川椒方各组、空白血清组对细胞活力的影响与作用时间有关。在一定的时间内(48h),随作用时间延长,抑制细胞活力的能力逐渐提高,此后(72h),有效作用浓度下降,对细胞活力影响不大。分析各血清组浓度对细胞活力的影响,发现四组细胞活力较好的作用浓度多为10%,结合血清细胞毒性实验,细胞在10%浓度药物血清中活力较好,本实验选择了10%浓度血清作为实验浓度。(3)根据酶底物法检测β-氨基己糖苷酶释放量的多少,发现抗体浓度为25μtg·L-1时,释放量最大,明显高于其他各组(P<0.01)；DNP-BSA作用15min时,释放量最大,明显高于其他各组(P<0.01)；川椒方高、中剂量组含药血清作用120min时,释放量最少(P<0.01)。(4)与正常组相比,模型组和阴性对照组肥大细胞脱颗粒明显(P<0.01)；β-氨基己糖苷酶释放率升高明显(p<0.01)；RBL-2H3细胞分泌IL-4和TNF-α增多(P<0.01)；IL-4和TNF-α mRNA表达增高(P<0.01)；p-AKT,p-ERK,p-p38,p-JNK表达增加(P<0.01)。与模型组和阴性对照组比较,各治疗组肥大细胞脱颗粒现象明显抑制(P<0.01)；β-基己糖苷酶释放率下降(P<0.01)；RBL-2H3细胞分泌IL-4和TNF-a减少(p<0.01)；IL-4和TNF-α mRNA表达下降(p<0.01)；p-AKT,p-ERK, p-p38,p-JNK表达下降(P<0.01)。川椒方抑制肥大细胞脱颗粒作用与浓度呈正相关。4结论(1)川椒方能够治疗变态反应性结膜炎,其作用机制可能是通过稳定肥大细胞,抑制其脱颗粒实现的。(2)川椒方“稳定肥大细胞,抑制其脱颗粒”的作用可能与其影响肥大细胞脱颗粒过程中AKT,ERK,p38,JNK磷酸化水平有关。