家禽卵泡发育质量的好坏决定了蛋鸡的产蛋性能。在卵泡发育过程中,超过95%的卵泡都发生了闭锁,只有不到5%的卵泡可以正常发育至排卵。与高产期蛋鸡相比,低产期蛋鸡卵巢中等级前卵泡的数量尤其是小白卵泡（Small white follicle,SWF）和大白卵泡（Largewhitefollicle,LWF）等级前卵泡是由一根卵泡柄悬吊在卵巢皮质上,卵巢通过卵泡柄中的血管为卵泡的发育提供生长因子、激素和营养。因此血管数量的多少对卵泡的发育具有重要的调控作用。本实验以海兰白蛋鸡为实验对象,利用组织形态学观察和细胞分子生物学检测技术并结合转录组测序技术探究了卵泡发育过程中的关键基因和信号通路。并通过比较低产期蛋鸡和高产期蛋鸡卵泡的差异,利用体内实验和体外实验相结合的方法探究了卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone,FSH）和 N-氨甲酰谷氨（N-carbamylglutamate,NCG）通过影响卵巢中血管的生成调控卵泡发育,同时发现了NCG对蛋壳质量的提高作用,为生产中提高蛋鸡的产蛋率,降低鸡蛋的破损率提供了方法。1.高产蛋鸡卵泡的转录组分析家禽卵泡发育的好坏决定了产蛋量的高低。在实验研究的过程中发现,低产期蛋鸡的等级前卵泡数量显著少于高产期蛋鸡。低产蛋鸡血浆E2和P4水平也低于高产蛋鸡。针对这种现象,为了探讨等级前卵泡减少的机制,本实验采用RNA测序技术（RNA-seq）对SWFs、小黄卵泡（Small yellow follicle,SYF）和等级卵泡（F6）发育过程中的主要调控基因和信号通路进行了分析和验证。KEGG分析发现在SWFs发育至SYFs,SYFs发育至F6时都富集到了 VEGF、类固醇激素合成、过氧化物酶体增殖剂激活受体（Peroxisomeproliferators-activated receptorsγ,PPAR-γ）、紧密连接和缝隙连接信号通路。而且通过差异基因表达分析的聚类热图显示,与SYFs发育至F6相比,SWFs发育为SYFs时,基因表达谱发生了较明显的变化。因此,在验证性实验中,本研究选择了 SWFs与SYFs进行比较。使用Western blot实验技术发现,与SWF相比,SYF中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体 VEGFR1、VEGFR2,以及血管生成素（Angiopoietin,ANGPT1和ANGPT2）等相关蛋白表达均显著上调,而色素上皮细胞衍生因子（Pigment epithelium derived factor,PEDF）的表达明显下降（P<0.05）。同时,与SWFs相比,SYFs研磨液中,E2和P4的含量分别增加了 131.6%和22.2%。且SYFs中过氧化物酶体增殖剂激活受体PPAR、载脂蛋白（Apolipoprotein,APOA1和APOLD1）、PPAR、极低密度脂蛋白（Very low density apolipoprotein,VLDL）mRNAs的表达量显著上调,occludinmRNA的表达量显著下调（P<0.05）。同时Western blot结果显示,SYFs中,VLDLR和PPAR-γ蛋白的表达量上调而occludin的表达量下调（P<0.05）。以上数据表明:当SWFs发展为SYFs时,血管生成、类固醇激素生成和卵黄沉积能力均升高。SYFs中类固醇浓度的提高可能促进了肝脏中卵黄前体的合成,为卵泡沉积提供条件。同时,SYFs中血管的增加以及紧密连接标志蛋白occludin表达量的减少为卵黄通过颗粒细胞间隙运输到卵母细胞提供了快速的转运通道。2.FSH通过增加低产期蛋鸡卵泡膜层血管的生成促进卵泡发育在前期的实验过程中发现,与高产期蛋鸡相比,低产期蛋鸡等级前卵泡的数量,特别是SWFs和LWFs的数量明显减少。而且,与健康卵泡相比,闭锁卵泡中血管数量显著降低。与此同时,随着SWFs发育至SYFs,卵泡中卵泡刺激素及其受体（FSHR）的表达量显著上调,而当SWFs和SYFs发生闭锁时,卵泡中FSH和FSHR的表达量显著下调。那么FSH和卵泡发育之间有什么联系,又是怎样进行调控的呢?于是本实验采用免疫荧光染色、免疫组织化学染色、BrdU、TUNEL、Western bolt、RT-qPCR等方法研究了 FSH在家禽体内和体外对卵泡发育的影响。结果表明,注射FSH可以显著促进低产期蛋鸡体内等级前卵泡和等级卵泡的数量。类固醇激素合成相关的基因（STAR、CYP19A1、CYP17A1、CYP11A1）mRNAs表达量显著升高,血浆中雌二醇（17β-estradiol,E2）、孕酮（Progesterone,P4）、黄体生成素（LH）水平也显著升高（P<0.05）。同时,体外培养的结果显示,FSH通过上调缺氧诱导因子（Hypoxia-induced factor,HIF）的表达,促进卵泡体细胞增殖,抑制细胞凋亡（P<0.05）。此外,FSH通过提高VEGF、VEGFR和ANGPT的表达来促进卵泡膜层血管的生成。FSH还能促进肝脏中卵黄的合成,减少颗粒细胞间紧密连接相关基因和蛋白的表达。总的来说,FSH促进了卵泡中类固醇激素水平的升高,进而促进了卵泡膜层中血管生成以及肝脏中卵黄的合成,并且减少了紧密连接的表达。血管数量的增加促进了卵黄的沉积。此外,颗粒细胞间紧密连接的减少使卵黄前体VLDL更容易进入卵母细胞,促进卵黄的快速沉积。因此,FSH通过调节血管生成、类固醇激素以及紧密连接的生成以及卵黄沉积促进了卵泡发育。3.N-氨甲酰谷氨酸通过增加卵巢中血管生成促进卵泡发育N-氨基谷氨酸是N-乙酰-L-谷氨酸的类似物,能增加哺乳动物体内精氨酸的合成,提高繁殖能力。目前,NCG对家禽生产性能的影响尚不清楚。本实验旨在从卵巢的组织形态、细胞分子水平并结合RNA-seq探索NCG对鸡卵泡发育的影响。通过添加不同剂量和饲喂不同的时间的NCG对饲料中NCG的添加剂量和饲喂时间进行了筛选。结果表明,与对照组相比,饲料中添加1%NCG饲喂14 d后,卵母细胞直径>60 μm的卵泡所占的比例显著升高（P<0.05）,促进了卵泡的发育,同时采食量和饲料转化效率也显著提高。血浆氨基酸（AA）检测结果表明,饲料中添加1%NCG可显著提高血浆中AA的水平（P<0.05）。结合RNA-seq分析结果显示,饲喂NCG上调了雏鸡卵巢中与血管生成（VEGFA、VEGFC）和细胞增殖相关基因（CCND1、CDK2、CDK3）的表达,同时下调了与凋亡相关基因（BAX、caspase-3）的表达。以上结果提示:饲料中添加NCG增加了血浆中NO水平,上调了卵巢中PKG-I、Raf1、p-p38蛋白的表达,促进了卵巢中血管生成。与此同时,NCG促进了卵泡体细胞的增殖抑制了卵巢体细胞的凋亡,并最终促进了卵泡的发育。4.饲喂N-氨甲酰谷氨酸可提高蛋鸡蛋壳质量卵母细胞发育后期进入输卵管中形成完整的蛋。蛋壳质量的下降严重降低了鸡蛋的质量等级,增加了禽蛋的破损率。据统计,在禽蛋生产中,因蛋壳破损造成的损失占总产蛋量的6%-8%。因此,降低蛋壳破损率也是提高禽蛋产量的重要措施。本研究通过探究NCG对钙吸收和钙沉积的影响,评价其对蛋壳品质的影响。将30只0d蛋鸡随机分为两组:对照组（基础日粮）和实验组（基础日粮+1%NCG）饲喂25周。25周龄时,收集鸡蛋并进行蛋壳质量的检测。在产蛋后16h采集血浆进行矿物质元素、激素和氨基酸水平的分析检测。同时取一部分子宫部组织于4%中性多聚甲醛溶液中固定用于组织形态的观察,另一部分组织保存于液氮中进行矿物质元素的检测、RT-qPCR及Western blot的检测。结果表明,饲料中添加1%NCG饲喂25周后,蛋壳质量（蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋壳百分比、蛋壳比重和蛋壳有效厚度）显著提高。同时,使用扫描电镜对蛋壳的超微结构进行了观察,发现在蛋壳的超微结构中,乳突层有效厚度、乳突间隙的宽度、乳突密度明显减少。NCG组中,蛋壳、血浆和子宫部中钙、磷、铁、镁、钠、钾的含量显著升高（P<0.05）。同时,NCG组蛋鸡血浆中,调控钙代谢相关激素E2、甲状旁腺激素（PTH）和降钙素（CT）的浓度显著升高（P<0.05）。此外,添加NCG后,蛋鸡子宫部、十二指肠和肾脏中钙结合蛋白（CALB1）、碳酸酐酶2（CA2）、卵清蛋白（OVA）、卵转铁蛋白（OVO）、卵磷脂-17（OC-17）、卵磷脂-116（OC-116）和凝聚素（CLU）mRNAs的表达以及CALB1和内质网钙ATP酶蛋白（ATP2A1）蛋白的表达均上调（P<0.05）。同时,根据形态学观察,NCG组中,蛋鸡子宫部的血管数量、子宫部皱褶的高度、皱褶面积以及皱褶上绒毛长度均显著增加（P<0.05）。即饲料中添加1%NCG饲喂25周可以通过改变蛋鸡子宫部的形态结构、促进子宫部血管生成,并促进肠道对Ca2+的吸收,调控钙代谢相关的基因和激素的表达水平,促进子宫部蛋壳的钙沉积,提高蛋壳质量。综上所述,通过RNA-seq分析并发现了调控等级前卵泡发育的关键信号通路和关键基因。血管生成、类固醇激素生成和卵黄沉积是调控SWFs发展为SYFs的重要因素,同时紧密连接在等级前卵泡发育的过程中表达量减少,为卵黄前体物质的运输提供了快速的转运通道。FSH可以通过调控HIF的表达促进卵泡中类固醇激素的合成,同时增加卵泡中血管的生成。这些变化促进了肝脏中卵黄前体物质的合成和转运。而卵泡中颗粒细胞之间的紧密连接生成量的减少可以促进经血液运输至卵泡膜层的卵黄前体物质在颗粒细胞间的转运,使卵黄前体物质更快速的转运到卵母细胞,促进了卵泡的发育。同时,NCG可以通过增加雏鸡血浆中NO的水平,增加雏鸡卵巢中血管的生成的数量,促进卵巢体细胞的增殖,抑制细胞凋亡,并最终促进卵泡的发育。而且还发现,NCG看可以通过改变蛋壳的子宫部的形态结构、促进子宫部血管生成、调控钙代谢相关的基因和激素的表达促进子宫部蛋壳的钙沉积,提高蛋壳质量。以上研究结果不仅为促进低产期蛋鸡卵泡发育提供了理论基础,而且为禽蛋生产中提高禽鸡的产蛋率,降低禽蛋的破损率提供了方法。