家禽卵巢中早期卵泡的发育与卵母细胞及颗粒细胞之间的物质传递和信息通讯密切相关,而细胞因子在其中扮演了重要的媒介作用。细胞因子能促进细胞的增殖和生长,而且还可以调节细胞的迁移、分化和有丝分裂。细胞因子包含很多种类,各种细胞因子经由旁分泌或自分泌以及卵母细胞和颗粒细胞间的物质运输、信号通讯对卵泡形成发育产生作用:调控颗粒细胞的增殖分化、激素分泌和其他细胞因子生成等。而细胞因子参与家禽早期卵泡生长发育相关的研究很少。同时家禽的繁殖性能是畜牧业上比较关注的问题,而早期卵泡发育对于最终的繁殖性能是有决定性影响的。所以对细胞因子在早期卵泡发育中的调控作用开展深入研究是有意义的。本实验以雏鸡为研究对象,检测雏鸡卵泡发育中基因的表达量变化以及利用已经建立的体外培养的卵巢模型来研究两种细胞因子,即碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）在雏鸡早期卵泡发育中的调控作用和其中的机理,为家禽产蛋性能的后续研究提供理论依据。1.雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化雏鸡早期卵泡的形成和发育涉及许多基因表达的变化。本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验样品,利用RNA-seq的实验技术来研究早期雏鸡卵巢中miRNA的表达。取D0、D4、D7的雏鸡卵巢各三个,用于RNA-seq分析。在RNA-seq建库结果中对miRNA进行质检,筛选出有显著差异表达的基因来进行RT-qPCR的验证,验证结果是趋势一致,RNA-seq结果可信。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有10种表达显著差异的miRNA,包括8条上调基因,2条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有50种表达显著差异的miRNA,包括35条上调基因,15条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有18种表达显著差异的miRNA,包括12条上调基因,6条下调基因。对差异表达miRNA的靶基因做汇总,结果显示,D4vs D0中,靶基因与细胞的抗凋亡和细胞因子作用相关;D7vs D0中,靶基因与细胞抗凋亡、细胞因子作用和激素合成相关;D7vs D4中,靶基因与缝隙连接、细胞因子作用、MAPK信号通路相关,其中涉及的靶基因有GJA5、HLF、MAP3K14等。上述结果表明,miRNA可通过缝隙连接、细胞抗凋亡、卵巢发育信号相关通路和细胞因子作用等方面来影响雏鸡卵泡的发育。2.雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验材料,用RNA-seq来分析雏鸡卵巢中lncRNA水平随时间的变化。并像上一章一样筛选出有显著差异表达的基因并用RT-qPCR来进行验证,使用GO数据库把有表达差异的lncRNA靶基因做富集处理分析,使用KEGG数据库给表达差异的lncRNA靶基因做通路注释。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有106种表达显著差异的基因,包括65条上调基因,41条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有305种表达显著差异的基因,包括214条上调基因,91条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有109种表达显著差异的基因,包括52条上调基因,57条下调基因。RT-qPCR的验证实验证实了 RNA-seq结果的可靠性。GO数据库的结果表明差异表达的lncRNA靶基因大多富集于抗原受体介导的信号通路、细胞因子的合成和非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性等生理活动,KEGG数据库结果显示差异的表达lncRNA靶基因大多与细胞因子-细胞因子受体间的相互作用、细胞黏附分子和卵泡发育相关的信号通路有关。其中D7 vs D4结果显示,不少靶基因为细胞因子或细胞因子受体的lncRNA表达明显增加,其中包括了FGF2,IL6R以及GDF9等。上述结果表明,lncRNA可通过细胞因子、细胞连接以及卵泡生长相关的信号通路等方面促进早期雏鸡卵泡的形成和发育,其中相关的细胞因子有FGF2,LIF和GDF9等。3.bFGF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用许多细胞因子在雌性原始卵泡激活的过程中发挥重要的促进作用。而RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因中有FGF2。同时先前也有研究报道,FGF2在大鼠中可以促进原始卵泡的激活。FGF2在禽类调节原始卵泡激活的作用研究很少。本实验检测了细胞因子bFGF和FSH对原始卵泡发育的相互刺激作用及其可能的信号机制,包括蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路。对4日龄雏鸡卵巢进行3天的bFGF和FSH处理,观察bFGF和FSH对卵泡发育的影响。本研究采用HE染色、免疫组化、实时定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫荧光等方法。在鸡早期卵巢中发现,bFGF受体（FGFR1）mRNA表达和原始卵泡激活的时间进程之间有变化的相关性。bFGF与FSH的相互刺激作用在原始卵泡的激活过程中表现为促进颗粒细胞的增殖、减少细胞的凋亡。FGFR1的抑制剂SU5402减弱了 bFGF的促进作用,降低了生长卵泡的比例。AKT和ERK信号通路介导了 bFGF和FSH促进原始卵泡激活的作用。上述研究结果表明,细胞因子bFGF和FSH通过PI3K-AKT和ERK信号通路对鸡早期卵巢颗粒细胞的增殖和抗凋亡产生相互刺激作用,促进原始卵泡激活。4.LIF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因也有IL6R,IL6R与LIF的受体组成有关。LIF对雏鸡原始卵泡激活的作用研究较少。本实验检测了细胞因子LIF和bFGF在原始卵泡发育过程中的作用和相互之间的关联,以及涉及到的信号通路,包括了 AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路。对出雏后4天的雏鸡进行卵巢组织的取材,并用LIF和bFGF单独或者联合处理3天,观察卵泡发育情况的变化。本研究采用HE染色、免疫组化、Western blot、透射电镜、免疫荧光等实验方法。结果显示,LIF以及其受体（LIFR）蛋白表达的变化与早期卵泡的发育过程之间有一定的时间相关性。LIF和bFGF的对于促进原始卵泡的激活有一定的协同作用,而具体的表现是促进卵泡细胞的增殖、同时减少卵泡细胞的凋亡。而LIFR的抑制剂SC144能够抑制LIF的这种促进原始卵泡激活的作用。同时AKT和ERK信号通路也参与了 LIF和bFGF这两者促增殖抑凋亡的过程,而Wnt/β-catenin信号通路在其中也有一定的介导作用。上述研究结果表明,LIF和bFGF可通过促进雏鸡卵泡细胞的增殖和抑制其凋亡,并产生协同作用从而促进原始卵泡的激活,这一过程中会涉及到AKT,ERK和Wnt/β-catenin信号通路。本实验利用RNA-seq来检测雏鸡卵巢卵泡发育过程中基因表达量的变化,将有显著表达差异的lncRNA与miRNA汇总并进行对比补充,发现在雏鸡原始卵泡激活阶段,靶基因与FGF2和LIF有关的lncRNA表达显著增加;利用已建立的卵巢组织体外培养模型,研究bFGF和LIF在雏鸡卵巢中原始卵泡激活的调控作用,发现FSH与bFGF发挥协同作用,可通过PI3K-AKT和ERK信号通路对雏鸡早期卵巢中颗粒细胞的增殖和抗凋亡的刺激作用从而促进卵泡激活;而LIF和bFGF可通过协同作用促进卵泡细胞增殖并抑制其凋亡,再通过AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路促进卵泡激活。这些结果将为后续深入研究家禽卵泡发育的调控机制以及提高家禽产蛋性能奠定一定的理论基础。