【摘 要】
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展青霉素（patulin）是一种不饱和内酯类真菌毒素,由扩展青霉等真菌在特定条件下产生,在果蔬尤其是苹果中的污染在全球范围内都较为严重。展青霉素可引发多种急性病症,具有神经毒性、免疫毒性和遗传毒性,不仅会极大地影响产品品质、造成经济损失,而且会严重威胁食品安全和人畜健康。生物酶降解法因绿色高效等优势逐渐成为当前国内外展青霉素脱除中的研究热点,但是目前有关展青霉素降解酶的报道并不多见,具备展青霉素降
【基金项目】
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陕西省重点农业项目（编号:NYKJ-2019-XA-008）
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展青霉素（patulin）是一种不饱和内酯类真菌毒素,由扩展青霉等真菌在特定条件下产生,在果蔬尤其是苹果中的污染在全球范围内都较为严重。展青霉素可引发多种急性病症,具有神经毒性、免疫毒性和遗传毒性,不仅会极大地影响产品品质、造成经济损失,而且会严重威胁食品安全和人畜健康。生物酶降解法因绿色高效等优势逐渐成为当前国内外展青霉素脱除中的研究热点,但是目前有关展青霉素降解酶的报道并不多见,具备展青霉素降解能力的微生物酶类还有待开发。展青霉素分子结构中具有四氢吡喃环和不饱和内酯环,开环反应已被证实是其脱毒的重要途径。基于此,本研究聚焦于底物广泛、具备水解环氧化合物和催化内酯开环聚合能力的脂肪酶,从菌株筛选出发获得一株具备展青霉素降解能力的脂肪酶产生菌Ralstonia sp.SL312,并成功纯化制备出能有效降解展青霉素的脂肪酶RL12。主要研究内容和结果如下:（1）具备展青霉素降解能力的脂肪酶产生菌的分离筛选。以三丁酸甘油酯和橄榄油两种酯类为底物,通过固体平板观察水解圈大小和摇瓶发酵测定酶活两步筛选程序,从土壤中分离得到一株脂肪酶产生菌SL3-12。16S r DNA序列鉴定表明该菌株与罗尔斯通氏菌属（Ralstonia sp.）相似性达99.7%以上。菌株胞外发酵液能在54 h内降解80%以上的展青霉素,由此猜想其所产胞外脂肪酶很有可能在展青霉素的降解中发挥着重要作用。（2）展青霉素降解酶的分离纯化和性质研究。Ralstonia sp.SL312所产酶活集中在胞外,因此选择胞外发酵液为纯化对象,通过盐析提取和柱层析纯化步骤获得降解酶获得分子量为38 k Da的降解酶RL12,纯化倍数6.02倍,纯化酶比酶活达到398.62U/mg,纯化效果良好。通过高效液相色谱检测验证了纯化酶的展青霉素降解能力,证实了前文猜想。对脂肪酶RL12部分酶学性质进行了研究:最适反应温度50℃,最高耐受温度40℃;在p H 7.5～8.5稳定性较高,具备对酸性和碱性条件的耐受能力;Mg2+能提升其酶活力。（3）展青霉素降解产物分析及其细胞毒性评价。经过酶处理后,展青霉素最大吸收波长发生迁移,说明展青霉素结构发生变化被降解转化为另一种物质。通过液质联用分析了脂肪酶RL12降解展青霉素的产物,发现降解产物可能是相对分子质量为158Da的物质,结合二级质谱特征碎片,推断该物质由展青霉素内酯键和环氧结构断裂生成。利用人胚肾细胞HEK293、人源肝细胞LO-2和人结肠癌细胞Caco-2对降解产物进行了体外细胞毒性测试,结果表明经过酶处理后的展青霉素对三种细胞存活率显著提升,因此认为脂肪酶RL12具备展青霉素降解的应用潜力。（4）酶降解展青霉素特性及其在苹果汁中的应用研究。在缓冲溶液中探究了酶对展青霉素的降解特性,结果显示温度37℃、p H 7.5、酶用量100μg/m L和初始展青霉素浓度5μg/m L条件下展青霉素去除率较高。进一步研究了酶对苹果汁中展青霉素的脱除效果,评价了酶处理对果汁基本理化指标和挥发性香气成分的影响。结果表明,在上述最佳降解条件下,酶能在24 h内去除85%以上的展青霉素;经过酶处理后,苹果汁中可检测到的游离酚、柠檬酸和几种挥发性风味成分显著增加,但也伴随着几种香气成分的降低和消失,酶解作用可能会使果汁营养和感官品质发生微弱的变化。
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