我国经济的快速发展带来了当前的空气污染问题,特别是反复出现的雾霾,引起了政府和公众的关注。雾霾主要由大气环境中存在的颗粒物(Particulate matter,PM)引起,特别是空气动力学直径(AD)<2.5 gm的细颗粒物,一般称为PM2.5。呼吸系统是颗粒物暴露的首要作用对象,流行病学研究显示PM2.5与多种呼吸系统疾病相关,如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等。一般认为,颗粒物的毒性与颗粒物的直径密切相关,直径越小,毒性越大,但当前对超细颗粒物(AD≤0.1 μm, ultrafine particle, UFPs)的健康危害研究不够全面与深入。需要指出的是,真实环境中的颗粒物样本成分复杂,直径分布不一,研究结果不易重复且难以分析。因此,实验室研究中常采用成分与直径单一的人工合成颗粒物作为替代物。肺纤维化是慢性肺疾病发生发展过程中的重要病理改变,表现为肺泡上皮细胞持续性损伤、成纤维细胞过度增殖活化、尤其是胶原过度沉积,最终能引起呼吸衰竭。肺纤维化的机制尚未完全阐明,但认为由多种机制共同调控。早期研究发现,炎症反应是介导肺纤维化的关键机制,细胞因子释放、氧化应激、成纤维细胞活化增殖在发病过程中也发挥重要作用；近期研究显示,肺泡上皮细胞损伤同样在肺纤维化发生发展中扮演关键角色。已有动物实验报道表明UFPs经肺灌注后,能够诱导小鼠肺纤维化,但其发病机制的研究仍停留在氧化应激、炎症反应及细胞因子等方面,UFPs是否可以通过直接损伤肺泡上皮细胞而诱导肺纤维化?尚无文献报道。为探索UFPs对肺泡上皮细胞的作用及其在肺纤维化中的贡献,本学位论文拟以人工合成的纳米级颗粒模拟大气中的UFPs,研究该颗粒物诱导的肺泡上皮细胞损伤机制及其在小鼠肺纤维化中的作用。为此,本论文首先采用小鼠肺灌注模型模拟人体呼吸道颗粒物暴露过程,建立UFPs诱导肺纤维化模型。暴露1个月后,检测小鼠肺功能并收集小鼠的肺组织进行后续检测。呼吸功能检测结果显示,UFPs暴露显著降低小鼠肺顺应性；UFPs暴露后解剖小鼠,肉眼观察可见肺部呈现弥散状白色斑点,且明显增大,肺脏器系数显著增加；Masson染色及天狼猩红胶原染色表明,UFPs处理组小鼠胶原纤维的含量较对照组明显增加；组织羟辅氨酸分析证明,UFPs处理增加小鼠肺组织中羟辅氨酸含量；qRT-PCR检测CTGF基因的结果显示,UFPs暴露上调其表达量；免疫组化结果表明,肺组织中α-SMA的表达量在UFPs处理之后显著上调。以上结果充分证明,UFPs诱导小鼠肺纤维化的实验模型已成功建立。进一步,我们采用电镜观察UFPs在小鼠肺组织中的定位,结果显示二型肺泡上皮细胞可以吞噬颗粒物,且肺组织凋亡增加。为了证明动物水平的结果是正确的,我们对体外培养细胞进行UFPs处理,同样观察到肺泡上皮细胞摄取UFPs,并发生凋亡。以上结果表明UFPs能够靶向肺泡上皮细胞,提示肺泡上皮细胞损伤与UFPs诱导的肺纤维化相关。细胞自噬是真核生物中一种依赖溶酶体降解胞内生物大分子和受损细胞器的过程,在维持细胞内环境稳定及应对环境刺激中起重要作用,其紊乱已经被证实参与了肺纤维化的多个过程。那么,自噬是否参与UFPs诱导的肺纤维化呢?为此,在本论文的小鼠肺纤维化模型中,我们利用免疫印迹与免疫组化技术检测了自噬相关分子,结果显示自噬的主要分子标记物LC3-Ⅱ在UFPs暴露的小鼠肺组织中显著上调,提示自噬可能参与了UFPs诱导的肺纤维化。为了详细阐明UFPs影响细胞自噬的分子机制,我们在细胞水平开展深入研究。以A549细胞为研究对象,本论文证实UFPs确实可以引起肺泡上皮细胞自噬泡聚集。进一步,我们全面检测了UFPs对自噬流的三个过程,即自噬泡生成、自噬溶酶体与自噬泡融合、自噬溶酶体降解的影响。结果显示,UFPs不影响自噬调控蛋白mTOR的活性,说明经典的mTOR信号通路并未参与UFPs诱发的自噬泡聚集过程；免疫印迹检测表明,UFPs处理并不促进自噬性降解底物蛋白p62的降解,反而增加细胞内p62蛋白水平,提示自噬泡聚集源自于自噬性降解的抑制。一般认为,自噬泡形成之后,需要与溶酶体融合形成自噬溶酶体,继而在自噬溶酶体内完成对底物的降解过程。我们的结果显示,UFPs不影响自噬泡和溶酶体的融合,但能够损伤溶酶体的降解能力。进一步的研究发现,UFPs处理导致肺泡上皮细胞的溶酶体肿胀,抑制溶酶体的正常酸化,从而抑制酸性水解酶(如组织蛋白酶D)的成熟。采用外加cAMP回复UFPs引起的溶酶体酸化抑制,可以加快细胞的自噬流降解,减少UFPs诱导的细胞凋亡。此外,我们的实验结果表明,UFPs可以上调A549细胞IL-1与IL-6的基因表达水平,而cAMP回复溶酶体酸化及rapamycin加快自噬流均能够下调IL-1与IL-6的水平,说明超细颗粒物引起的自噬紊乱还可以调控炎症反应。现场采集的颗粒物样本同样能够上调A549细胞中LC3,p62蛋白的表达,表明自噬流阻断在真实暴露中同样存在。最后,本论文在动物体内对细胞水平的研究结果进行了验证。免疫印迹与免疫组化的结果表明,UFPs暴露上调小鼠肺组织中p62蛋白表达水平,说明体内结果与体外一致,即UFPs抑制自噬性降解。进一步,在体内采用rapamycin加快自噬流干预UFPs诱导肺纤维化的过程后,检测肺纤维化相关的表型。天狼腥红染色结果表明,小鼠暴露UFPs后用rapamycin进行干预,胶原聚集显著减轻；羟辅氨酸检测结果显示,rapamycin显著下调小鼠肺组织中羟辅氨酸含量；此外,免疫组化结果可见rapamycin下调肺组织中α-SMA的表达量。以上结果充分证明rapamycin干预组小鼠肺纤维化明显减轻,说明自噬流阻断是UFPs诱导肺纤维化的发病机制。根据以上结果,我们得出结论：UFPs通过影响肺泡上皮细胞溶酶体酸化而抑制自噬性降解,导致肺泡上皮细胞自噬紊乱,继而诱导细胞凋亡以及上调炎症因子表达,从而介导了肺纤维化的发生。