乳房炎主要是由于病原微生物引起的,其发病率高(25%-60%),是奶牛最常见的疾病之一,也是造成世界各国奶牛业损失最严重的疾病之一。Toll-like receptors (TLRs)能够识别病原体相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern, PAMP),在天然免疫防御病原体中起着重要作用。TLR4是TLRs家族成员之一,它能够识别革兰氏阴性菌细胞壁成分中的脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid),通过信号转导,诱导促炎症因子等基因的表达,使机体产生抗病性。为了探索乳房炎抗性的分子机理,本研究以中国西门塔尔牛、三河牛和中国荷斯坦奶牛为研究对象,利用生物信息学与分子生物学相结合的方法,克隆了抗菌相关基因TLR4及其信号转导通路上的重要基因IRAK1、IRAK2、IRAK-M、IRAK4、TRAF6、TOLLIP和TIRAP,并进行了生物信息学分析;推导了这些基因编码的氨基酸序列,进行了蛋白质特性与功能预测;分离了TLR4基因组DNA,检测了TLR4基因的SNPs,并对其中4个SNPs与乳房炎(衡量指标为体细胞数)的关联进行了分析,得到如下主要结果:1.用电子克隆(e-PCR)、反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆并鉴定了牛TLR4、IRAK2、IRAK-M和IRAK4基因的全长cDNA序列,发现了2个IRAK2选择性剪接体、3个IRAK-M选择性剪接体和2个IRAK4选择性剪接体。2.分离并得到了牛IRAK1、TRAF6、TOLLIP和TIRAP基因cDNA的编码区(CDS)全长和部分非翻译区序列。3.检测了TLR4、IRAK1、IRAK2、IRAK-M、IRAK4、TRAF6和TOLLIP基因在乳腺、肝、肌肉、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢共11个组织中的表达情况,结果表明TLR4、IRAK1和IRAK4基因在11个组织中均有表达;IRAK2基因在乳腺、肝、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达;IRAK-M基因在乳腺、肝、肌肉、十二指肠、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达;TRAF6基因在乳腺、肝、肌肉、十二指肠、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达;TOLLIP基因在乳腺、肝、脂肪、肾、心、胰和卵巢7个组织中有表达。4.根据牛TLR4基因cDNA的开放阅读框(ORF)推导了该蛋白的氨基酸序列,并通过生物信息学方法对其特征和功能进行了预测分析,预测结果表明牛TLR4基因编码841个氨基酸,其中1-23氨基酸为信号肽序列,635-657氨基酸为跨膜区,即1-634氨基酸位于膜外,658-841氨基酸位于膜内;该蛋白包含LRR、LRR-TYP、LRRCT和TIR共4个功能结构域,根据其结构域的功能,推断牛TLR4蛋白可能通过信号转导途径,引发机体的免疫应答,使机体产生抗病性。5.推导了IRAK1、IRAK2、IRAK-M、IRAK4、TRAF6、TOLLIP和TIRAP基因所编码的蛋白质序列,并采用生物信息学方法预测了这些蛋白的特征和功能域,预测结果表明这7个基因所编码的蛋白都是TLR4信号转导途径中的重要分子;还发现IRAK2的2个选择性剪接体(IRAK2a,IRAK2b)的结构域有不同之处,即IRAK2a存在死亡结构域,而IRAK2b没有死亡结构域,根据死亡结构域的功能,推测这2个剪接体在TLR4基因信号转导中的功能可能不同。6.分离了牛TLR4基因的全长DNA序列,并进行了SNP s检测,发现了31个SNPs,其中5′非翻译区有2个SNP,第1外显子有4个SNP,第1内含子有11个SNP,第2外显子有1个SNP,第2内含子有2个SNP,第3外显子有11个SNP。7.采用RFLP、SSCP和CRS-PCR法检测了TLR4基因5′侧翼区G→C的突变、EXON2 -24位点A→G的突变、T4CRBR2位点T→C的突变和TIR2AA位点C→T的突变在中国西门塔尔牛、三河牛和中国荷斯坦奶牛3个群体中的多态性,结果表明,除了中国西门塔尔牛群体在TIR2AA位点处于低度多态以外,其他3个群体在4个位点均处于中度多态。8. TLR4基因与奶牛乳房炎(衡量指标为SCS)的关联分析表明,在EXON2 -24位点和TIR2AA位点上,AA基因型可能为乳房炎抗性基因型(P<0.05),A等位基因可能为乳房炎抗性的有利基因,而在5′侧翼区和T4CRBR2位点上,各基因型个体的SCS差异不显著(P>0.05)。