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绵羊和山羊肉孢子虫具有较强致病性,根据感染卵囊或孢子囊量的不同可引起宿主厌食、减重、发热、贫血、脱毛、流产、早产、神经症状、肌炎和死亡。本实验采用光学显微镜、电子显微镜和分子生物学手段,对寄生于昆明绵羊和山羊的肉孢子虫的自然感染率、形态学和分子系统学进行了研究。 采集绵羊肉样21份,共发现绵羊肉孢子虫3种:羊肉孢子虫(S.tenella)、白羊犬肉孢子虫(S.arieticanis)、肉孢子虫未定种1(Sarcocystis sp.1)。绵羊肉孢子虫的自然感染率为61.90%(13/21),其中羊肉孢子虫的感染率为47.62%(10/21),白羊犬肉孢子虫的感染率为33.33%(7/21),肉孢子虫未定种1的感染率为9.52%(2/21)。采集山羊肉样60份,共发现山羊肉孢子虫3种:山羊犬肉孢子虫(S.capracanis)、家山羊犬肉孢子虫(S.hircicanis)和肉孢子虫未定种2(Sarcocystis sp.2)。山羊肉孢子虫的自然感染率为56.67%(34/60),其中山羊犬肉孢子虫的感染率为50%(30/60),家山羊犬肉孢子虫的感染率为15%(9/30),肉孢子虫未定种2的感染率为5%(3/60)。 绵羊和山羊肌肉组织内发现的6种肉孢子虫包囊在光镜下都呈白色,梭状。羊肉孢子虫包囊大小为786.81-3683.50×36.50-88.15μm(n=19),包囊壁具栅栏状或指状突起,突起长1.3-6.3μm(n=45);电镜下突起呈栅栏状,大小为2.0×0.5μm,基质层厚度约为0.3μm,突起顶端具有盘状结构。白羊犬肉孢子虫包囊大小为705.63-3295.46×72.85-97.46μm(n=13),包囊壁具毛发状突起,突起长3.0-11.6μm(n=55),电镜下突起呈骨头状,突起内无微管,基质层厚度约为0.3μm。肉孢子虫未定种1包囊大小为956.34-2251.03×69.07-104.65μm(n=7),包囊壁光滑。山羊犬肉孢子虫包囊大小为310.66-2542.63×28.23-111.56μm(n=19),包囊壁具栅栏状或指状突起,突起长0.9-8.8μm(n=45);电镜下栅栏状突起内无微管,突起顶端具有盘状结构,基质层厚度约为0.7μm。家山羊犬肉孢子虫包囊大小为1000.23-3440.54×25.63-101.32μm(n=17),包囊壁具毛发状突起,突起长1.07-6.40μm(n=60);电镜下突起内无微管,基质层厚度约为0.15μm。肉孢子虫未定种2包囊大小为876.55-3542.78×36.50-80.86μm(n=10),包囊壁光滑。羊肉孢子虫、白羊犬肉孢子虫的包囊分别与山羊犬肉孢子虫、家山羊犬肉孢子虫的包囊的光镜形态和电镜形态相似。肉孢子虫未定种1和肉孢子虫未定种2的光镜形态也相似。 分别取羊肉孢子虫、白羊犬肉孢子虫、肉孢子虫未定种1、山羊犬肉孢子虫、家山羊犬肉孢子虫、肉孢子虫未定种2的单个包囊提取基因组DNA,用2对肉孢子虫18SrRNA基因的通用引物:18S-1S/18S-2A、18S-2S/18S-3A,扩增出约1800bp的18S rRNA基因;用3对肉孢子虫28S rRNA基因的通用引物:28S-KL1/KL3、28S-KLA/KL5b、28S-KL6a/KL2,扩增出约3600 bp的28SrRNA基因。18S rRNA基因序列比对发现:羊肉孢子虫与山羊犬肉孢子虫的同源性为99.04%,白羊犬肉孢子虫与家山羊犬肉孢子虫的同源性为98.85%,肉孢子虫未定种1与肉孢子虫未定种2的同源性为98.59%;28SrRNA基因序列比对发现:羊肉孢子虫与山羊犬肉孢子虫的同源性为98.41%,白羊犬肉孢子虫与家山羊犬肉孢子虫的同源性为96.42%,肉孢子虫未定种1与肉孢子虫未定种2的同源性为95.87%。 利用MEGA5软件,基于18S rRNA基因序列、28S rRNA基因序列,采用N-J法所构建的绵羊和山羊肉孢子虫的系统进化树都提示:羊肉孢子虫、山羊犬肉孢子虫、白羊犬肉孢子虫、肉孢子虫未定种1、家山羊犬肉孢子虫、肉孢子虫未定种2的终末宿主都是犬的肉孢子虫构成一个支系,在这个支系里面,白羊犬肉孢子虫、肉孢子虫未定种1、家山羊犬肉孢子虫、肉孢子虫未定种2具有较近的亲缘关系,构成一个单系群;羊肉孢子虫和山羊犬肉孢子虫的亲缘关系较近,构成一个单系群。 Heckeroth et al.(1999)设计出了能有效区分羊肉孢子虫和白羊犬肉孢子虫的特异性引物8/ST3和2/SA1。本次实验利用8/ST3引物不但在羊肉孢子虫而且亦在山羊犬肉孢子虫的包囊中扩增出了530 bp的特异性条带,利用2/SA1的特异性引物不但在白羊犬肉孢子虫而且亦在家山羊犬肉孢子虫包囊中扩增出了375 bp的特异性条带。因此,8/ST3并不能有效区分羊肉孢子虫和山羊犬肉孢子虫,2/SA1不能有效区分白羊犬肉孢子虫和家山羊犬肉孢子虫。用引物KL1/KL3扩增羊肉孢子虫与山羊犬肉孢子虫的部分28 rRNA基因片段,扩增产物的DNA片段大小一致,分别用XhoⅠ和EcorⅠ酶切后,产生的酶切图谱一致。 绵羊和山羊的肉孢子虫形态学与分子生物学的研究表明了绵羊和山羊的肉孢子虫包囊形态相似的虫种,亦具有很高的分子同源性,且形态相似、系统发生同源的种类其终末宿主也相同,绵羊和山羊是否拥有相同的肉孢子虫种尚需深入的研究。