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里氏木霉中已发现的调控纤维素酶、半纤维素酶的转录因子包括Cre1、ACEⅠ、ACEⅡ、Xyr1和Hap2等。其中,Cre1和ACEⅠ属于转录抑制因子,ACEⅡ是转录激活因子。Cre1、ACEⅠ和ACEⅡ都是锌指蛋白。具锌指结构转录因子多具有模块结构,一般由DNA结合结构域和转录效应(激活或抑制)结构域组成。我们将转录激活因子ACEⅡ的激活结构域融合到转录抑制因子Cre1和ACEⅠ的DNA结合结构域之间,构建了一个编码嵌合体转录激活因子的质粒pChi。大肠杆菌中表达的嵌合体转录因子Cre1-ACEⅡ-ACEⅠ在体外可以很好的结合在cbh1启动子上,而且它的结合能力比只含有一个DNA结合结构域的Cre1-ACEⅡ和ACEⅡ-ACEⅠ结合能力都要强得多,显示同一个蛋白中Cre1 DNA结合结构域和ACEⅠDNA结合结构域在结合启动子DNA时对彼此有相互稳定的作用。将质粒pChi转化到里氏木霉高产菌株RUT C-30中,得到一株产纤维素酶和半纤维素酶能力大大提高的转化子菌株4C4。代表性的纤维素酶和半纤维素酶基因的转录水平都有所提高。
4C4株除了产酶能力提高外,在生长性状上也有变化。我们对CAA是否还对纤维素酶和半纤维素酶外其它基因发生了转录激活作用进行了进一步探讨。利用抑制性消减杂交得到了19个基因。SSH实验发现的这19个基因的1000-bp启动子上都含有Cre1和ACEⅠ的结合基序(对Cre1是5’-SYGGRG-3’,对.ACEⅠ是5’-AGGCA-3’)。其中有7个基因的启动子上具有更可靠的ACEⅠ结合序列5’-AGGCAAA-3’。凝胶阻滞实验发现,Cre1能结合到所有19个启动子上,但ACEⅠ只能结合7个具5’-AGGCAAA-3’启动子中的6个。这19个基因,绝大部分基因的表达受到葡萄糖的抑制。
在SSH发现的cDNA克隆中,caa-9编码一个推定的小热休克蛋白HSP23。酵母乙醇脱氢酶的热变性聚沉保护实验证明HSP23具有分子伴侣的功能。它还能保护限制性内切酶PstⅠ免受热变性。从30℃到50℃,HSP23的分子伴侣活性随温度升高逐渐升高。在pH5.1,HSP23仍然具有相当的活性。HSP23能促进纤维素酶水解木质纤维素,但不能促进纤维素酶水解Avicel结晶纤维素。