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CMM是高度恶性的皮肤肿瘤,其发生和发展归因于独立或联合的遗传和表观遗传事件。在遗传改变方面,对了解CMM发病机制取得了显著进展。最近的研究揭示了 RNA相关表观遗传机制在基因表达调控中的重要参与,包括非编码RNA的多种活性以及RNA甲基化。基于课题组前期研究结果,本课题对THOC2 RNAi的A375细胞进行IncRNA表达谱分析,发现了包括Lnc-PKNOX1-1在内的一系列相关lncRNA存在表达差异,并在亚洲人好发的CMM亚型ALM的肿瘤组织中得到了验证。此外,RNA甲基化修饰相关研究在肿瘤领域取得了突破性进展,其参与了多种肿瘤的发生发展过程,与免疫治疗耐受的发生密切相关,基于此,本课题分析了RNA甲基化修饰与ALM的相关性,并测定了甲基化修饰相关酶在ALM组织中的表达情况。为接下来的Lnc-PKNOX 1-1及RNA甲基化修饰参与ALM发病机制的深入研究指明了方向。第一部分:LncRNA表达谱芯片筛选ALM相关LncRNA目的:探讨lncRNA在ALM中的作用和相关机制。方法:构建THOC2 RNAi的A375细胞系,以未处理的A375细胞系作为对照组进行lncRNA表达谱分析;对差异基因进行GO和KEGG富集分析;q-RTPCR验证芯片中部分相关LncRNA的表达水平,2-AACt方法分析数据。结果:表达芯片筛选出数个与ALM相关的lncRNA,其中 lnc-PKNOX1-1 在内的 LncRNA在THOC2RNAi的A375细胞系中表达显著下调,并且PTEN/PI3K/AKT信号通路显著衰减。10例ALM组织中验证lnc-PKNOX1-1在癌组织中有高表达趋势。结论:lnc-PKNOX1-1可能促进ALM的发病,起到致瘤作用,可能是通过PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥其功能。第二部分:RNAm6A甲基化修饰在ALM中的研究目的:探讨ALM中是否存在甲基化修饰及其在ALM中的作用机制。方法:收集40例经病理证实为ALM病人的癌及癌旁组织,使用Trizol试剂从收集的样品中提取组织总RNA。通过q-RTPCR验证ALKBHb5、FTO、METTL3等RNA甲基化相关酶的表达水平,采用2-ΔACt方法分析数据。通过WB检测METTL3在癌组织及癌旁组织中的表达水平;通过RNA甲基化定量实验测定ALM总RNA甲基化水平。结果:RNA甲基化定量实验显示ALM癌组织中的RNA甲基化水平相较癌组织中升高;QPCR结果显示ALKBHb5、FTO、METTL3、METTL14在ALM癌及癌旁组织中表达存在差异,差异具有显著性,其中METTL3在癌组织中显著高表达(P<0.0001),ALKBHb5在癌组织中显著高表达(P<0.01),METTL14和FTO在癌旁组织中显著高表达(P<0.0001);Western blot结果显示癌组织的METTL3蛋白水平明显升高。结论:高的RNA甲基化水平可能在ALM的致瘤过程中扮演重要角色。其中,METTL3和FTO可能分别在ALM中扮演癌基因和抑癌基因的角色。