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随着蛋白质药物需求量的递增,酵母表达系统逐渐引起人们的关注。基因工程的快速发展,使酵母的人源化改造成为可能。本实验室前期已经通过二次同源重组技术成功敲除毕赤酵母的α-1,6-甘露糖转移酶(OCHlp)基因,阻断了酵母的高甘露糖基化途径,得到了过度糖基化缺陷株GJKOI (OCHI-),然后把酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因内质网定位信号与来自拟南芥的α-1,2-甘露糖苷酶I(α-1, 2-mannosidase I, MDS I)基因融合,定点整合到毕赤酵母基因组上,获得了能够合成哺乳动物Man5GlcNAc2复杂型甘露糖型的人源化糖基工程酵母,部分实现了酵母的人源化改造,已用于蛋白质药物的表达。但是酵母表达系统仍然存在一些缺陷,影响了它的推广,这其中就包括糖基工程酵母N-糖基化不完全和过度O-糖基化的问题,我们对此开展了研究。对于酵母N-糖基化修饰不完全的问题,我们采用导入外源N-糖基转移酶的方式予以改善。利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记,在酵母菌株4-32中转入醇氧化酶启动子(alcohol oxidase promoter, AOX1)控制的利士曼原虫N-糖基转移酶(stauroporine and temperature sensitivity3, STT3)D亚基,构建一株过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母菌株4-32-STT3D。通过SDS-PAGE, Western Blot和N-糖肽酶(peptide-N-asparigine amidase F, PNGase F)酶切等方法,分析其表达的抗HER2抗体(anti-human epidermal growth factor receptor 2)的N-糖基化程度。SDS-PAGE结果显示,4-32-HL酵母菌表达的抗HER2抗体除与哺乳动物细胞表达的商业化的抗体有相同的55×103左右的重链主带外,还有一条相对分子质量约为50×103的条带. PNGase F酶切后,上述重链均呈50×103的均一条带,WesternBlot分析证明这些条带均为抗体成分。则50×103的均一条带条带即为未糖基化的抗体重链。而转入STT3D的工程菌4-32-HL-STT3D菌表达的抗HER2抗体则为均一的55×103条带,无未糖基化的50×103条带。用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)作为报告蛋白验证STT3D的作用,SDS-PAGE发现普通糖基工程酵母菌4-32-GMCSF表达的GM-CSF呈现为22×103和20×103的两条带,而转入STT3D后的4-32-GM-CSF-STT3D工程菌表达的则为均一的22×103条带。PNGase F酶切后,这些条带均为相对分子质量约18×103的均一条带。由于GM-CSF有Asn27,Asn37两个N-糖基化位点,所以推测22×103是两个位点均发生了糖基化形成的条带,20×103是仅一个位点发生糖基化形成的条带。考虑到STT3D表达载体由AOX1甲醇诱导型启动子控制启动,所以我们分别研究了STT3D基因非诱导和STT3D诱导时对酵母生长的影响。统计学分析显示STT3D非诱导时,转入STT3D的4-32-HL-STT3D菌(+STT3D)与未转入STT3D的阴性对照菌4-32-HL(-STT3D)生长情况相比,p=0.032>0.01,说明两者无显著区别,提示STT3D非诱导时对酵母生长没有影响；STT3D诱导时,p<0.0001,两者差异性显著,提示STT3D诱导表达对酵母生长影响十分明显。另一方面对于酵母过度O-糖基化修饰的问题,常规手段是采用敲除的方式阻断基因表达,但是考虑到酵母O-糖基转移酶PMTs对酵母生长是不可或缺的,敲除致死,拟采用可诱导的阻遏方式抑制该过程。根据参考文献报道的CRISPR-Cas9具有的靶向敲除功能,将Cas9突变为dcas9,并由dcas9设计成由诱导型启动子D6控制诱导表达,这样dcas9既保留了与靶位点特异性结合的能力,又失去了核酸内切酶活性,还具有诱导控制PMTs基因启动的特点。为了让dcas9阻遏蛋白进入细胞核发挥作用,我们采用了在dcas9基因的3’端融合核定位信号(nuclear localization sequence, NLS)编码区和在dcas9基因的5’端和3’端均融合NLS编码区两种策略。pmt-gRNA基因由pmt1-gRN、pmt2-gRNA和pmt4-gRNA基因串联形成,其转录出的pmt1-gRNA, pmt2-gRNA和pmt4-gRNA mRNA分别锚定到pmt1、pmt2和pmt4的转录起始位点上游,由此构建了pGE-D6-dcas9-pmt-gRNA和pGE-D6-NLS-dcas9-pmt-gRNA两种靶向阻遏载体,利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记转入酵母JC3O7 (ura3-,his-)菌。再将仅有O-糖基化位点而不具有N-糖基化位点的粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)导入JC307 (ura3-, his-)作为报告蛋白,诱导表达后质谱分析两种靶向阻遏载体表达的阻遏蛋白对G-CSF的O-糖基化抑制效果。MALDI-TOF-MS质谱结果显示,无dcas9的阴性对照菌表达的G-CSF两个峰值有9803.2,19612.9两个峰值,仅C端含NLS的dcas9菌株表达的G-CSF有9801.9,19614两个峰值,和阴性组峰值接近,表明该方式融合的CRISPR-dcas9靶向阻遏系统无抑制O-糖基化的作用：而dcas9的两端均有NLS的菌株表达的G-CSF有四个峰值：9645.4,9806.9,19296.3和19620.7,其中9806.9和19620.7与阴性组峰值接近,另外还出现的19296.3峰和19620.7相差324.4,约是两个甘露糖残基的相对分子质量,提示G-CSF O-糖基化程度减弱,说明该方式融合的CRISPR-dcas9靶向阻遏系统发挥了作用,一定程度上抑制了G-CSF的过度O-糖基化修饰。