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本文应用植物生理生化与细胞、分子生物学方法,研究了茉莉酸甲酯(methylJasmonate,MJ)对滇紫草培养细胞生长及其次生代谢物-紫草宁生物合成的影响,分析了与此生物合成相关的关键酶活性;另一方面,利用基因差异显示技术,克隆及分析了可能参与滇紫草紫草宁合成调控的表达序列标签(expressedsequencetag,EST)片段;此外,就滇紫草培养细胞次生代谢调控的可能分子机制进行了探讨。
众所周知,茉莉酸和茉莉酸甲酯是植物抗胁迫反应中的信号分子。目前对外源的茉莉酸广谱的生理作用的报道包括了MJ对植物的各项形态学指标和生理学指标的抑制以及促进作用。我们的实验则分别检测了MJ对滇紫草细胞紫草宁合成的影响以及MJ(浓度为0.001mg/L,0.01mg/L,0.1mg/L,1mg/L)和IAA(0.05mg/L,0.1mg/L,5mg/L),MJ(浓度设置与上同)和BAP(0.05mg/L,0.1mg/L,5mg/L)之间在细胞生长和紫草宁合成上的交互作用,并检测了MJ对对羟基苯甲酸(PHB)香叶基转移酶和对羟基苯甲酸葡糖基转移酶活性的影响。
在B5培养基中对细胞生长的影响上,MJ与IAA和BAP之间有着极显著的交互作用。MJ对细胞的生长具有抑制作用,而当B5培养基中不加IAA和BAP时,MJ对细胞生长的抑制作用则更加显著。
在M9培养基中,接种后的第4天以MJ处理将会对滇紫草细胞的紫草宁合成产生最显著的影响。MJ处理对紫草宁的合成具有促进作用:在0.001~1mg/L的浓度范围内,紫草宁的产量随着MJ浓度的增加而升高。MJ和IAA、BAP之间对紫草宁合成的影响也有显著的交互作用。紫草宁合成的最适的MJ和IAA组合为MJ1mg/L,IAA0.05mg/L,最适的MJ和BAP组合为MJ1mg/L,BAP0.5mg/L。MJ可以显著提高PHB-香叶基转移酶的活性,而同时显著降低PHB-葡糖基转移酶的活性。由此,我们推测MJ促进紫草宁合成的一种机制可能是影响紫草宁合成中的重要酶类的酶活性,从而最终促进紫草宁的合成。
另外,使用γ射线诱导培养基中的滇紫草细胞突变,以紫草宁产量为标准,经小团快愈伤法筛选,选出紫草宁产量不同的4种突变体M,M-1,M-2和M-3,其中突变体M不产生紫草宁。
以暗培养条件下的正常愈伤组织B(可以产生紫草宁),光培养条件下的正常愈伤组织L(不产生紫草宁)以及暗培养的不产生紫草宁的突变体M为材料,并对其进行基因的差异显示(DD-RT-PCR),共得到19条DNA差异片段。PCR扩增后,以pMD-18Tvector为载体,大肠杆菌DH5α菌株为宿主,对其中的18条进行T/A克隆。选取与光反应密切相关的片段1和片段14测序后,在NCBI基因库中BLASTn分析序列。我们预测片段1所在基因是核基因组的一部分,具有类似NDAH脱氢酶的功能,并且可能会参与质膜氧化还原系统的电子传递过程。光照可以诱导片段1和片段14的转录水平的表达,并且抑制了紫草宁的合成。但片段14的BLASTn结果中未发现与之具有相同序列的已知基因。