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[目的]先天性颅颌面部缺损及畸形的诊治是长期以来口腔颌面外科医师所面临的一项挑战。因此,探究颅颌面发育畸形的原因及机制对于临床诊疗及优生优育具有重要意义。目前只有少数颅颌面发育畸形的发病机制得到解释并明确定位,如van der Woude综合征、腘翼综合征均由IRF6突变所致,常染色体隐性遗传腭裂由PVRL1缺失所致。部分恒牙缺失及腭裂突变由Msx1突变引起等。但大多数疾病并无明显遗传特征,多为表观遗传水平改变。而转录调控作为表观遗传调控的重要组成部分,其在发育、肿瘤、炎症等过程中均起核心调节作用。同源盒基因作为转录因子的核心组分,对颅神经嵴细胞来源的颅颌面发育过程起着重要的调控作用。而作为同源盒基因的组成成分之一的Dlx家族,其在胚胎发育中的缺失或表达异常会出现一系列的功能障碍。既往研究中,Dlx2的基因敲除鼠及我们课题组之前构建的Dlx2颅颌面条件性过表达转基因小鼠均出现较多的颅颌面先天发育畸形,如异位软骨、成骨障碍等。然而,对于Dlx2在成骨和成软骨过程中的具体调控机制尚不清楚。本课题拟对Dlx2在小鼠间充质来源的细胞成骨和成软骨分化中的调控作用开展系列研究并探讨其调控机制。[材料和方法]本研究分为两部分。第一部分:选择小鼠颅盖骨来源的Mc3T3 E1细胞系及小鼠股骨来源的骨髓基质干细胞(m BMSCs),通过构建慢病毒提高Dlx2在上述细胞成骨向分化过程中的表达水平。通过实时定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术(WB)验证已构建好的Dlx2过表达细胞系;茜素红及碱性磷酸酶染色技术等对过表达细胞株及对照组进行染色及相应定量分析;实时定量PCR技术进行可能靶向因子的筛选;染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)、荧光素酶报告基因检测技术、蛋白免疫共沉淀技术(co-IP)技术对可能机制及靶向因子进行验证,由此得到Dlx2在间充质来源的细胞成骨向分化过程中扮演的角色及机制。第二部分:选择小鼠颅底联合软骨细胞及小鼠TMC-23软骨细胞系,通过构建慢病毒提高Dlx2在上述细胞成软骨向分化过程中的表达水平。通过实时定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术(WB)验证Dlx2过表达细胞系;基因芯片技术进行候选靶基因的筛选;阿利新蓝染色染色技术等对过表达细胞株及对照组进行染色及相应定量分析;染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)、荧光素酶报告基因检测技术对可能机制及靶向因子进行验证,由此得到Dlx2在间充质来源的细胞成软骨向分化过程中的作用及可能机制。[结果]第一部分:1、成功构建Dlx2过表达的小鼠成骨前体细胞系(Mc3T3 E1 cells)。2、Dlx2过表达后,碱性磷酸酶染色及茜素红染色明显更深,碱性磷酸酶定量分析表明成骨活性增强。3、通过荧光实时定量的方法从成骨相关基因分子通路里筛选可能的靶向基因osteocalcin,在Mc3T3 E1、C3H10 T1/2细胞系及m BMSCs中验证Dlx2的过表达均能够明显上调osteocalcin的表达水平。4、荧光素酶报告基因实验表明Dlx2过表达能够上调携带osteocalcin启动子2kb序列的荧光素表达水平;Ch IP实验能够在第八段序列内部得到阳性条带;而将上述阳性序列的片段定点突变后,携带突变后osteocalcin启动子序列的质粒的荧光素酶的表达水平与空白组较为一致。5、蛋白质免疫共沉淀实验发现Dlx2过表达的样品能够检测到Msx2的表达,提示Msx2可能做为一个共转录因子参与了Dlx2的成骨促进作用。第二部分:1、成功构建Dlx2过表达的小鼠软骨前体细胞系(TMC23 cells),并将过表达Dlx2的TMC23细胞及转染空载病毒的TMC23细胞样本进行基因芯片分析。2、Dlx2过表达后,软骨相关的阿利新蓝染色着色明显更深。3、将1芯片分析结果与软骨发育相关的基因进行集合分析,得出Dlx2可能通过与以下基因相互作用参与软骨分化过程:MMP2、MMP13、MMP14、VEGFa、VCAM1、ICAM1、Sox6、Fibin、Adam 12、Adam 15、Dlx5、ECM。之后通过q RT-PCR、Western Blot及通路相关分析,定位MMP13是Dlx2参与软骨分化的核心作用因子。4、将MMP13的上游2kb启动子序列进行荧光素酶报告基因实验分析,得出在Dlx2过表达的细胞内部,Dlx2的过表达能够明显抑制携带MMP13启动子的荧光素酶的发光水平;同时染色质免疫共沉淀实验(Ch IP)分析表明在MMP13启动子区域的第四段序列出现明显富集;且将上述核酸序列内部的可能结合位点进行定点突变后,荧光素的表达水平能够回归到空白对照组水平。[结论]Dlx2可通过结合于osteocalcin的启动子序列的,提高osteocalcin的转录水平,促进间充质细胞来源的Mc3T3 E1细胞系和小鼠BMSCs成骨向分化;此外,Dlx2可通过结合于MMP13的启动子序列,降低MMP13的转录水平及翻译水平,继而抑制间充质细胞来源的TMC-23细胞和小鼠颅底软骨细胞的细胞外基质的降解,从而参与软骨终末分化的调控。