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由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)引发的一种接触性传染病被称为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),此病的典型症状是造成母猪的繁殖障碍和仔猪、生长猪的呼吸困难。PRRSV全长约15.4kb,至少包含ORF1a,ORF1b,ORF2a,ORF2b和ORF3~ORF7等10个相互重叠的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。ORF1a和ORF1b主要编码RNA聚合酶和复制酶等非结构蛋白,ORF2~ORF7负责编码PRRSV结构蛋白:GP2,GP3,GP4,GP5,GP6(M蛋白)和GP7(N蛋白)。分析GP6蛋白的氨基酸序列,我们发现在其24~29个氨基酸的位置,存在一段免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。ITIM基序是一段含有保守结构L/I/VXYXXL/V(X为任意一种氨基酸)的抑制序列,当其中的酪氨酸发生磷酸化后可以招募肌醇多磷酸磷酸酶(SHIP-1)、蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2等含有SH2区域的磷酸酶,从而使这些含有SH2区的磷酸酶具有催化活性,进而调节细胞内信号通路的传导。本试验主要研究PRRSV结构蛋白GP6中所包含的ITIM基序对IFN-β产生的激活机制,首先,根据Genbank中猪GP6基因序列设计一对带有合适酶切位点的引物,以实验室保存的PRRSV毒株VR2332为模板扩增GP6片段,克隆到真核表达载体pcDNA3.0中,构建了重组表达载体pcDNA3.0-GP6。然后运用重叠延伸PCR技术,设计一组具有互补末端的引物,将缺失掉ITIM基序后的两个片段连接在一起,构建了重组表达载体pcDNA3.0-GP6△ITIM。后经生物公司测序,结果与其相对应的目的基因同源性高达99%以上,说明两个重组质粒均构建成功。随后,用构建成功的质粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM以及空载体pcDNA3.0分别转染生长状态良好的Marc-145细胞,并设置Marc-145细胞空白对照,用荧光定量PCR方法检测TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-β等关键分子的mRNA转录水平,结果显示,GP6蛋白中的ITIM基序能够上调细胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-βmRNA转录水平,下调MyD88、TRAF6 mRNA转录水平,这表明ITIM基序调节的可能是TRIF介导的信号通路而不是MyD88介导的信号通路。用Poly(I:C)分别刺激转染组细胞,结果显示,ITIM基序能够进一步上调由Poly(I:C)激活的TRIF、IRF3、IRF7 mRNA的转录水平,对NF-κB、IFN-β的上调作用具有一定的时间限制。由此猜测GP6蛋白中的ITIM基序可能通过调节TLR3介导的TRIF依赖型信号通路来激活IFN-β的产生。为了进一步明确ITIM基序的免疫调节机制,本试验主要运用RNA干扰技术分别下调Marc-145细胞中对应的靶基因SHP-1、SHP-2,将构建保存的质粒pcDNA3.0-GP6与pcDNA3.0-GP6△ITIM转染进下调靶基因的Marc-145细胞中,通过荧光定量PCR检测TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-β等关键细胞因子的mRNA转录水平,结果发现,沉默Marc-145细胞中SHP-1基因后,GP6蛋白中的ITIM基序从12h开始能够显著下调细胞中TRIF、IRF3、IRF7、IFN-βmRNA转录水平,对NF-κB的调节作用不明显。沉默SHP-2基因后,ITIM基序对TRIF、IRF-3、NF-κB、IFN-β的调节规律均为先升高,再降低,然后趋于稳定,对IRF-7mRNA水平则能够持续上调,到48h以后。研究结果表明SHP-1在PRRSV结构蛋白GP6中所含的ITIM基序激活IFN-β的信号传导途径中起关键作用,而ITIM基序与磷酸酶SHP-2的关系还需要科研工作者的进一步探索。