论文部分内容阅读
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化道恶性肿瘤。早期结直肠癌患者经治疗后5年生存率可达90％以上，但往往早期结直肠癌患者很少有临床症状，不易被发现。而晚期结直肠癌患者的5年生存率不足10％。因此，寻找一个有效的易于筛查及早期诊断结直肠癌的试验方法，对结直肠癌的治疗甚至治愈有很重要的意义。目前常用的结直肠癌筛查、诊断方法，如粪便隐血试验(Fecal Occult Blood Testing，FOBT)及结直肠镜检查等存在特异性、敏感性或患者依从性的不足，限制了其在结直肠癌筛查及早期诊断中的广泛应用。由于粪便脱落细胞在粪便中的持续、稳定存在性，2009年《美国胃肠病学会结直肠癌筛查指南》已经明确将检测粪便DNA甲基化情况作为推荐筛查方法。 Ras相关区域家族1A基因(Ras association domain family1A，RASSF1A)是一种抑癌基因。目前研究发现其在多种肿瘤中检测到RASSF1A基因异常甲基化导致转录沉默，尤其是在结直肠癌中，有研究发现其甲基化率可高达81％。Runt相关转录因子3(Runt related transcription factor3，RUNX3)亦为肿瘤抑制基因，其编码的RUNX3蛋白是TGF-β信号传导通路下游中一个非常重要的转录因子，对细胞的分化、细胞周期调控、凋亡起负性调节作用。RUNX3基因的甲基化或等位缺失可致其表达异常。现在诸多研究证明，RUNX3表达和消化道恶性肿瘤相关。hMLH1基因是错配修复基因中最重要的一种。在肿瘤细胞中，hMLH1基因功能的失活可能是由于其启动子区CpG岛被高度甲基化，而使得hMLH1基因不能表达。Kuismanenu等在研究36例散发性MSI结直肠癌中，发现30例(92％)发生了hMLH1的高甲基化。可见hMLH1甲基化在散发性结直肠癌的发生中起重要作用。 目的: 应用甲基化特异性PCR(methylated-specific PCR，MSP)法联合检测结直肠癌、结直肠腺瘤、结直肠非腺瘤性息肉、正常对照组粪便及组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化情况，探讨其对结直肠癌筛查、早期诊断的价值及与结直肠癌临床病理特征的关系。 方法: 1、收集2013年1月至2013年10月期间在河北医科大学第二医院和第四医院就诊或住院的56例结直肠癌、27例结直肠腺瘤、32例结直肠非腺瘤性息肉患者及30例内镜检查未见异常者的粪便标本及组织标本，记录临床及病理资料。 2、使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便DNA及酚-氯仿抽提法提取组织DNA，选取符合标准的DNA后应用MSP法联合检测RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化情况。 结果: 1、粪便DNA甲基化分析结果 共提取粪便样本147例，最终扩增出人β-actin基因片段的共145例，其中结直肠癌组、结直肠腺瘤组、结直肠非腺瘤性息肉组和正常对照组分别为56例，27例，32例和30例。结直肠癌患者粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为53.57％、58.93％、50.00％，91.07％的结直肠癌患者粪便中至少可以检测到有一个基因甲基化，特异性75.28％;结直肠腺瘤患者粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为33.33％、37.04％、25.93％，66.67％的结直肠腺瘤患者粪便中至少可以检测到有一个基因甲基化;其中进展型腺瘤患者粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为38.89％、44.44％、33.33％，77.78％的进展型腺瘤患者粪便中至少可以检测到有一个基因甲基化;非腺瘤性息肉患者粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为9.38％、9.38％、6.25％，9.38％的非腺瘤性息肉患者粪便中至少可以检测到有一个基因甲基化;正常对照组粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为0％、3.33％、0％，在正常对照组中检测到1例RUNX3基因甲基化。扩增成功的145例粪便标本进行FOBT检测，共有18例检测结果阳性，其中结直肠癌组17例（阳性率30.36％），进展型腺瘤组1例（阳性率3.70％），与联合检测粪便DNA甲基化相比，差异均有统计学意义(P＜0.001)。 结直肠癌患者粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化情况在肿瘤大小、浸润深度之间差异有统计学意义(P＜0.05)，在其他临床资料之间（除RUNX3与分化程度之间差异有统计学意义）差异无统计学意义。 结直肠腺瘤患者粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化程度在腺瘤的大小、伴上皮内瘤变级别(RUNX3除外)之间差异有统计学意义(P＜0.05)，在组织类型之间差异无统计学意义。 检测粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲基化对于早期结直肠癌和进展型腺瘤的发现率分别为42.86％、57.14％、42.86％，特异性为95.16％、93.55％、96.77％，联合检测3个基因甲基化对早期结直肠癌和进展型的发现率为80.36％，特异性为93.55％，阳性预测值为91.84％，阴性预测值为84.58％。 2、组织DNA甲基化分析结果 共有145例组织DNA样本进行MSP。结直肠癌组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为55.36％、60.71％、51.79％，92.86％的结直肠癌组织中至少可以检测到有一个基因甲基化，特异性69.66％;结直肠腺瘤组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为40.74％、44.44％、33.33％，70.37％的结直肠腺瘤组织中至少可以检测到有一个基因甲基化;其中进展型腺瘤组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为50.00％、55.56％、38.89％，83.33％的进展型腺瘤组织中至少可以检测到有一个基因甲基化;非腺瘤性息肉组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率为12.50％、25.00％、6.25％，25.00％的非腺瘤性息肉组织中至少可以检测到有一个基因甲基化;正常对照组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化率均为0％。 结直肠癌患者组织DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因启动子甲基化情况在肿瘤大小、浸润深度（组织中RUNX3除外）之间差异有统计学意义(P＜0.05)，在其他临床资料之间（除RUNX3与分化程度之间差异有统计学意义）差异无统计学意义。 3、粪便DNA中基因甲基化与组织DNA中基因甲基化情况的比较 RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲基化在结直肠癌组织和粪便之间、结直肠腺瘤组织和粪便之间，差异均无统计学意义。 结论: 1、RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因的甲基化率在正常对照、结直肠非腺瘤性息肉、结直肠腺瘤、结直肠癌中呈逐渐增高的趋势。 2、RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲基化率与结直肠癌患者肿瘤大小、浸润深度有关（组织中RUNX3除外），与其他临床资料（除RUNX3与分化程度之间差异有统计学意义）无关。 3、联合检测粪便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲基化对早期结直肠癌及进展型腺瘤的发现率高达80.36％，可以作为结直肠癌筛查和早期诊断的无创方法。