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乙型肝炎(hepatitis B)是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的全球范围的传染病,主要在肝脏发生病变。临床上,通过检测HBV血清标志物来辅助判断HBV感染与否、评价预后、治疗方案和药物反应等。近年来随着越来越多的研究,乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B core protein,HBc)作为新型检测HBV手段受到广泛关注。HBc单体构成同型二聚体,进一步包裹前基因组RNA(pregenome RNA,pgRNA)和HBV聚合酶组装为正20面体的核壳体。核壳体腔内包含HBV松弛环状DNA(relax circular DNA,rcDNA)和病毒聚合酶的复合体,最终和HBV包膜蛋白(hepatitis B surface protein,HBs)相互作用形成成熟病毒颗粒。HBV感染肝脏机制的深入研究发现,HBc尤为重要。目前乙肝病毒学界的共识认为,HBc的表达量与肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA(covalenty closed circular DNA,cccDNA)的功能活性正相关,通过定量检测HBc可以指示慢性乙肝患者体内cccDNA是否已经被清除或功能性失活。正对上述问题,我们在外源表达HBc新方法、靶向HBc特异性抗体和HBc定量检测这三方面内容开展相关研究工作。第一部分乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达目的:研究枯草芽孢杆菌中分泌表达重组HBc可行性。方法:1.HBc基因插入pBES-DNA穿梭质粒的MCS区域,获得pBES/HBc重组质粒。2.将pBES/HBc重组质粒酶切线性化后与信号肽DNA(Signal peptide library,SP DNA)库进行连接,连接产物转化stellar感受态细胞,收获全部阳性菌落并提取混合质粒。3.将混合质粒用化转的方法转入枯草芽孢杆菌RIK1285感受态细胞,检测信号肽,将包含不同信号肽的菌液进行放大培养,收集培养上清检测HBc分泌量。结果:重组HBc在枯草芽孢杆菌培养上清中存在,且有不同状态;经Western blot发现,Anti-HBc可以上清中重组HBc进行结合,具有高度特异性。结论:重组HBc在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,而且重组HBc蛋白表现出与天然状态类似的生物学活性。第二部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体库的构建目的:用T7噬菌体文库筛选的方法,建立靶向HBc单链抗体库。方法:1.将重组HBc/183和HBc/149作为抗原,免疫Balb/c雌性小鼠(6-8周)8周后,提取小鼠脾细胞mRNA,逆转录为cDNA。2.设计引物,cDNA作为模板,进行第一步PCR反应后,分别获得轻链可变区(VL),重链可变区(VH)基因DNA片段,进行第二步重叠延伸PCR技术(SOE PCR)反应,将轻链和重链拼接得到单链抗体(ScFv)基因库。3.ScFv基因片段双酶切后与T7Select10-3b连接,构成原代重组T7噬菌体库。4.重组HBc/183和HBc/149作为固相抗原与重组T7噬菌体进行亲和筛选,通过3轮筛选,富集得到与HBc/183和HBc/149结合的噬菌体文库,挑选重组T7噬菌体进行ELISA检测,筛选出亲和性高的重组T7噬菌体,对ScFv进行测序。结果:通过igblast软件分析ScFv基因片段框架区(FR)和互补决定区(CDR)的氨基酸序列。高富集氨基酸序列用来制备ScFv抗体库。结论:得到与重组HBc/183和HBc/149高亲和性结合的ScFv氨基酸序列,为临床检测HBc作基础。第三部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体对的筛选目的:筛选出靶向HBc的抗体对,用于HBc定量检测。方法:1.制备靶向HBc不同基因片段的亲和性抗体,共23种,其中1-14号靶向HBc蛋白C端150-183氨基酸区域,23-31号靶向HBc蛋白N端1-149氨基酸区域。2.每个ELISA平板与除其自身之外的ALP标记抗体形成抗体对,采用固定在平板上的抗体-抗原-ALP标记抗体模式,检测HBc。3.PBS作为对照组,不同ng级别的HBc样本组。用化学发光的方法检测不同组合的抗体对的发光值,筛选高亲和性的抗体对。结果:进行统计学分析,从中选出亲和性较高的抗体对。结论:不同抗体组对于HBc蛋白的亲和性不同,不同抗体组对于HBc蛋白不同检测限的检测有统计学意义。