论文部分内容阅读
微孢子虫(Microsporidia)是寄生范围广的单细胞真核生物,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是家蚕主要的传染性疾病微粒子病的病原体,给蚕业造成巨大的经济损失。家蚕微孢子虫体内没有三羧酸循环,但具有糖酵解(Glycolysis)途径。糖酵解过程中有三个关键反应,分别是葡萄糖在己糖激酶的作用下转化为6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖在磷酸果糖激酶的作用下转化为1,6-二磷酸果糖以及磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶(Pyruvate kinase)的作用下转化为丙酮酸,这三步均是不可逆反应。剪接因子(Splicing factor)是真核生物中RNA编辑的重要元件,经过剪接因子剪接可以产生许多具有功能的、带有编码信息的mRNA,对于生物体最基本的生命活动至关重要,同时对于真核生物基因正确表达相应蛋白也是不可或缺的一步。本课题对家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因和剪接因子基因及二者所编码的蛋白质做了研究,得到如下结果:(1)通过检索发现家蚕微孢子虫的丙酮酸激酶共有两个亚型,每个亚型各有3个拷贝。系统发育树和多序列比对结果的表明,家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的其中两个拷贝(EOB11679.1和EOB11685.1)相似性较高,可能具有相似的功能;选取家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的其中一个拷贝(NbPK-2,GenBank accession number:KB909845.1)及其氨基酸序列(NbPK-2,GenBank accession number:EOB11679.1)进行研究。其生物信息学分析结果显示:二级结构预测结果显示NbPK-2含有38%的螺旋,21%的延伸片段,40%无规则卷曲;NbPK-2中无序化区域约占5%,其余均是有序化片段;信号肽预测结果表明序列无信号肽。成功克隆出NbPK-2(KB909845.1)基因,该基因序列长度为1 359 bp,是一个完整的开放阅读框,编码452个氨基酸。实时荧光定量PCR(q-PCR)结果显示在接种微孢子虫后的第2 h,NbPK-2的相对表达量最高;此后一直到第24 h,NbPK-2的表达量都处于相对较高的水平;从第48 h开始,相对表达量出现了下降趋势,到第144 h到达最低值;在第168 h时,NbPK-2的相对表达量有所增加,高于第144 h。(2)经过检索发现家蚕微孢子虫剪接因子有两个拷贝,分别是EOB15199.1和EOB11739.1。选取家蚕微孢子虫剪接因子基因的其中一个拷贝(NbSF-1,GenBank accession number:KB908915.1)及其氨基酸序列(NbSF-1,GenBank accession number:EOB15199.1)进行研究。其生物信息学分析结果显示:NbSF-1与其他物种的剪接因子蛋白序列的相似性均较低,最高不超过60%;NbSF-1序列二级结构构成相对简单,其只有约6%的螺旋和6%的延伸片段,其余均是无规则卷曲结构,无信号肽;NbSF-1约有83%的氨基酸序列是无序化结构;包含磷酸化位点71个,N-糖基化位点22个,O-糖基化位点20个;亚细胞定位预测结果显示其可能定位在细胞质和细胞核。成功克隆出NbSF-1(KB908915.1)基因,该基因序列长度为1 449 bp,是一个完整的开放阅读框,编码482个氨基酸。q-PCR结果显示,在接种微孢子虫后的第2 h到第24 h,NbSF-1的相对表达量一直在上升;第24 h后开始降低,但在感染第48 h以后均处于相对平稳的表达水平,说明NbSF-1可能参与了微孢子虫的整个生活史。(3)通过构建重组表达载体,成功表达出NbSF-1蛋白;优化诱导表达条件后,当IPTG终浓度为0.5 mM的时候,在37℃条件下诱导4小时即可得到表达量相对较多的目的蛋白;纯化后的目的蛋白溶液的纯度明显高于未纯化的蛋白溶液,纯化成功;使用纯化后的NbSF-1蛋白多次免疫家兔,成功制备多克隆抗体。(4)间接免疫荧光结果显示,NbSF-1存在于休眠的家蚕微孢子虫内,随着微孢子虫的发芽而弹射至孢外,发芽后在孢外的细胞质中观察到荧光,但家蚕微孢子空壳中无荧光残留。证明NbSF-1位于家蚕微孢子虫的细胞质中,孢子壁、细胞核和极管上没有NbSF-1蛋白。