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我国采用鹿茸治疗肾阳虚已有几千年的应用历史，鹿茸可补充肾阳，强健体魄。药理学研究表明鹿茸总蛋白(SDAPR)对顺铂和庆大霉素诱导的急性肾损伤(AKI)具保护作用，但其活性蛋白并不完全明确，作用机制也尚未阐明。为全面了解SDAPR减轻药源性肾毒性的物质基础及分子机制，本文主要研究了SDAPR对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的急性肾损伤具保护作用的活性蛋白组分以及分子机制。
采用低浓度有机溶剂提取法提取脱脂后梅花鹿二杠茸中SDAPR，进行单因素试验优化SDAPR提取工艺，采用考马斯亮蓝法检测SDAPR中的蛋白质质量分数。实验结果显示，35%是此方法提取SDAPR的最佳乙醇浓度，SDAPR得率为40.21%，质量分数为92.6%。
研究SDAPR对APAP在人肾小管上皮细胞中诱导急性肾损伤的保护作用及其机制。采用APAP致HK-2细胞损伤体内肾毒性模型，以MTT法测定SDAPR对APAP诱导HK-2细胞存活率的影响，采用酶联免疫吸附剂测定法分别测定HK-2细胞上清液中肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和胱抑素C(Cys-C)等急性肾损伤生物标志物水平，以生化试剂盒方法分别测定HK-2细胞培养上清液中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、细胞裂解液中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量，以JC-10荧光探针法检测各组HK-2细胞线粒体膜电位变化，采用Hoechst33258染色法测定HK-2细胞核破碎及其致密浓染程度判断细胞凋亡水平，采用WesternBlotting测定各组HK-2细胞中Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase3的表达水平，并测定了各组HK-2细胞中血红素加氧酶1(HO-1)、人醌NADH脱氢酶1(NQO1)、NF-E2相关核因子2(Nrf2)和Kelch样ECH相关蛋白-1(keap-1)的蛋白表达水平。结果表明，SDAPR给药可显著增高APAP(10mM)诱导的HK-2细胞存活率(P＜0.01)，显著降低APAP诱导的HK-2细胞中KIM-1、NGAL、Cys-C、MDA和ROS的水平(P＜0.01)，显著增高APAP诱导的HK-2细胞中的GSH水平，CAT和SOD的活性(P＜0.01)，升高APAP诱导的HK-2细胞线粒体膜电位的降低(P＜0.01)，减少APAP诱导的HK-2细胞细胞凋亡的发生(P＜0.01)，降低APAP诱导的HK-2细胞中Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase3的升高(P＜0.01)，缓解APAP诱导的HK-2细胞中HO-1和NQO1水平的降低(P＜0.01)，缓解了APAP对HK-2细胞中Nrf2核易位的抑制(P＜0.01)，促进了HK-2细胞中被APAP抑制的Keap-1的降解(P＜0.01)。SDAPR预处理通过对Nrf2/Keap-1/HO-1途径的分子干预和对Keap-1的降解剂量依赖性地减轻对APAP致HK-2细胞的肾毒性、氧化损伤和细胞凋亡。
以柱层析色谱法使用SephadexG-100葡聚糖凝胶分离第一部分所得SDAPR，分别获得了5个不同组分的蛋白。通过APAP致HK-2细胞毒性模型采用MTT法和xCELLigence实时细胞分析术筛选得到2个具有拮抗APAP肾毒性作用的活性蛋白组分，分别命名为鹿茸蛋白组分1(SDAP1)和鹿茸蛋白组分2(SDAP2)。液相色谱-串联质谱(LC-MS / MS)结合数据库对比对产生的质谱数据进行鉴定并定量，并对鉴定到的蛋白进行GO及KEGG分析，对分析所得感兴趣蛋白进行序列比对，3D建模及进化树的构建。结果发现，SDAPR中具拮抗APAP肾损伤作用的活性蛋白可能是SDAP1和SDAP2中存在的Cu/Zn超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，14-3-3蛋白epsilon和鞘氨醇1-磷酸1受体蛋白，KEGG分析表明SDAPR，SDAP1和SDAP2均可能通过调节PI3K/Akt减轻APAP诱导的肾毒性。
研究了SDAPR，SDAP1和SDAP2对APAP致小鼠AKI的改善作用及保护机制。通过APAP致小鼠急性肾损伤模型，计算了小鼠体重变化和肾脏指数水平，并分别检测各组小鼠血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)，肾组织中KIM-1，NGAL和Cys-C水平，肾脏中SOD、Mn-SOD、CAT活性及GSH和MDA水平;以酶联免疫吸附剂测定法检测各组小鼠肾脏组织中的炎症因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平；HE、Masson、Hoechst33258和Tunel染色法观察组织病理学变化；通过吖啶橙染色确定HK-2细胞中的自噬水平；对PI3K-Akt途径及其下游Nrf2、NF-κB、FoxO1、p-FoxO1、mTOR和p-mTOR进行WB分析，测定了氧化应激相关蛋白酶HO-1、NQO1、自噬相关蛋白LC3和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase3的表达；另外，采用PI3K抑制剂(LY294002)在HK-2细胞中建立SDAPR，SDAP1和SDAP2保护机制验证模型。实验结果表明，SDAPR，SDAP1和SDAP2的预处理可显著抑制APAP致小鼠肾指数、SCr、BUN、KIM-1、NGAL和Cys-C水平的升高(P＜0.01)，增强小鼠肾脏中SOD、Mn-SOD、CAT活性以及HO-1和NQO1蛋白表达，降低APAP升高的小鼠GSH和MDA水平及小鼠肾脏组织中的TNF-α、IL-6水平(P＜0.01)，改善肾组织病理变化及肾脏细胞凋亡水平(P＜0.01)，降低APAP诱导的小鼠肾组织中Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase3的升高(P＜0.01)，减轻APAP诱导的HK-2细胞中的细胞自噬，并降低小鼠肾组织中LC3-II/LC3-I比率及Beclin-1的蛋白表达(P＜0.01)，SDAPR，SDAP1和SDAP2预处理激活了被APAP抑制的PI3K/Akt上游信号通路，从而促进Nrf2、p-mTOR并减少NF-κB、p-FoxO1蛋白的表达(P＜0.01)，然而，在HK-2细胞模型中，SDAPR，SDAP1和SDAP2对以上蛋白表达的影响被LY294002抑制。SDAPR，SDAP1和SDAP2可介导PI3K/Akt信号通路激活Nrf2、p-mTOR并抑制NF-κB、p-FoxO1从而抑制APAP诱导的氧化应激，细胞自噬和炎症反应，细胞凋亡，减轻肾损伤。
结合蛋白组学以及体内外药理学实验结果可知，SDAPR，SDAP1和SDAP2可有效减轻APAP诱导的HK-2细胞毒性和小鼠肾损伤，具肾保护的活性蛋白可能是SDAPR中的Cu/Zn超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，14-3-3蛋白epsilon和鞘氨醇1-磷酸1受体蛋白，其对APAP诱导AKI的肾保护分子机制与其调控PI3K/Akt信号通路有关。
采用低浓度有机溶剂提取法提取脱脂后梅花鹿二杠茸中SDAPR，进行单因素试验优化SDAPR提取工艺，采用考马斯亮蓝法检测SDAPR中的蛋白质质量分数。实验结果显示，35%是此方法提取SDAPR的最佳乙醇浓度，SDAPR得率为40.21%，质量分数为92.6%。
研究SDAPR对APAP在人肾小管上皮细胞中诱导急性肾损伤的保护作用及其机制。采用APAP致HK-2细胞损伤体内肾毒性模型，以MTT法测定SDAPR对APAP诱导HK-2细胞存活率的影响，采用酶联免疫吸附剂测定法分别测定HK-2细胞上清液中肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和胱抑素C(Cys-C)等急性肾损伤生物标志物水平，以生化试剂盒方法分别测定HK-2细胞培养上清液中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、细胞裂解液中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量，以JC-10荧光探针法检测各组HK-2细胞线粒体膜电位变化，采用Hoechst33258染色法测定HK-2细胞核破碎及其致密浓染程度判断细胞凋亡水平，采用WesternBlotting测定各组HK-2细胞中Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase3的表达水平，并测定了各组HK-2细胞中血红素加氧酶1(HO-1)、人醌NADH脱氢酶1(NQO1)、NF-E2相关核因子2(Nrf2)和Kelch样ECH相关蛋白-1(keap-1)的蛋白表达水平。结果表明，SDAPR给药可显著增高APAP(10mM)诱导的HK-2细胞存活率(P＜0.01)，显著降低APAP诱导的HK-2细胞中KIM-1、NGAL、Cys-C、MDA和ROS的水平(P＜0.01)，显著增高APAP诱导的HK-2细胞中的GSH水平，CAT和SOD的活性(P＜0.01)，升高APAP诱导的HK-2细胞线粒体膜电位的降低(P＜0.01)，减少APAP诱导的HK-2细胞细胞凋亡的发生(P＜0.01)，降低APAP诱导的HK-2细胞中Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase3的升高(P＜0.01)，缓解APAP诱导的HK-2细胞中HO-1和NQO1水平的降低(P＜0.01)，缓解了APAP对HK-2细胞中Nrf2核易位的抑制(P＜0.01)，促进了HK-2细胞中被APAP抑制的Keap-1的降解(P＜0.01)。SDAPR预处理通过对Nrf2/Keap-1/HO-1途径的分子干预和对Keap-1的降解剂量依赖性地减轻对APAP致HK-2细胞的肾毒性、氧化损伤和细胞凋亡。
以柱层析色谱法使用SephadexG-100葡聚糖凝胶分离第一部分所得SDAPR，分别获得了5个不同组分的蛋白。通过APAP致HK-2细胞毒性模型采用MTT法和xCELLigence实时细胞分析术筛选得到2个具有拮抗APAP肾毒性作用的活性蛋白组分，分别命名为鹿茸蛋白组分1(SDAP1)和鹿茸蛋白组分2(SDAP2)。液相色谱-串联质谱(LC-MS / MS)结合数据库对比对产生的质谱数据进行鉴定并定量，并对鉴定到的蛋白进行GO及KEGG分析，对分析所得感兴趣蛋白进行序列比对，3D建模及进化树的构建。结果发现，SDAPR中具拮抗APAP肾损伤作用的活性蛋白可能是SDAP1和SDAP2中存在的Cu/Zn超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，14-3-3蛋白epsilon和鞘氨醇1-磷酸1受体蛋白，KEGG分析表明SDAPR，SDAP1和SDAP2均可能通过调节PI3K/Akt减轻APAP诱导的肾毒性。
研究了SDAPR，SDAP1和SDAP2对APAP致小鼠AKI的改善作用及保护机制。通过APAP致小鼠急性肾损伤模型，计算了小鼠体重变化和肾脏指数水平，并分别检测各组小鼠血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)，肾组织中KIM-1，NGAL和Cys-C水平，肾脏中SOD、Mn-SOD、CAT活性及GSH和MDA水平;以酶联免疫吸附剂测定法检测各组小鼠肾脏组织中的炎症因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平；HE、Masson、Hoechst33258和Tunel染色法观察组织病理学变化；通过吖啶橙染色确定HK-2细胞中的自噬水平；对PI3K-Akt途径及其下游Nrf2、NF-κB、FoxO1、p-FoxO1、mTOR和p-mTOR进行WB分析，测定了氧化应激相关蛋白酶HO-1、NQO1、自噬相关蛋白LC3和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase3的表达；另外，采用PI3K抑制剂(LY294002)在HK-2细胞中建立SDAPR，SDAP1和SDAP2保护机制验证模型。实验结果表明，SDAPR，SDAP1和SDAP2的预处理可显著抑制APAP致小鼠肾指数、SCr、BUN、KIM-1、NGAL和Cys-C水平的升高(P＜0.01)，增强小鼠肾脏中SOD、Mn-SOD、CAT活性以及HO-1和NQO1蛋白表达，降低APAP升高的小鼠GSH和MDA水平及小鼠肾脏组织中的TNF-α、IL-6水平(P＜0.01)，改善肾组织病理变化及肾脏细胞凋亡水平(P＜0.01)，降低APAP诱导的小鼠肾组织中Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase3的升高(P＜0.01)，减轻APAP诱导的HK-2细胞中的细胞自噬，并降低小鼠肾组织中LC3-II/LC3-I比率及Beclin-1的蛋白表达(P＜0.01)，SDAPR，SDAP1和SDAP2预处理激活了被APAP抑制的PI3K/Akt上游信号通路，从而促进Nrf2、p-mTOR并减少NF-κB、p-FoxO1蛋白的表达(P＜0.01)，然而，在HK-2细胞模型中，SDAPR，SDAP1和SDAP2对以上蛋白表达的影响被LY294002抑制。SDAPR，SDAP1和SDAP2可介导PI3K/Akt信号通路激活Nrf2、p-mTOR并抑制NF-κB、p-FoxO1从而抑制APAP诱导的氧化应激，细胞自噬和炎症反应，细胞凋亡，减轻肾损伤。
结合蛋白组学以及体内外药理学实验结果可知，SDAPR，SDAP1和SDAP2可有效减轻APAP诱导的HK-2细胞毒性和小鼠肾损伤，具肾保护的活性蛋白可能是SDAPR中的Cu/Zn超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，14-3-3蛋白epsilon和鞘氨醇1-磷酸1受体蛋白，其对APAP诱导AKI的肾保护分子机制与其调控PI3K/Akt信号通路有关。