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相比于正常细胞,肿瘤细胞的代谢方式发生了显著变化。正常细胞主要通过氧化磷酸化途径获取能量,而肿瘤细胞主要通过糖酵解途径快速获得大量能量,肿瘤细胞的这种代谢方式被称为Warburg效应,已成为肿瘤的一个典型标志。尽管目前认为Warburg效应受到多种基因的调控,包括P53、c-myc和ERRα等。但是Warburg效应的转录调控机制仍不十分清楚。NR6A1(nuclear receptor subfamily 6group member1,NR6A1)是孤儿核受体家族成员之一,它是一种具有特定识别序列的转录抑制因子,可以特异性的结合任一DR0位点。研究表明,NR6A1具有促进胚胎干细胞分化的功能,并参与调节精子发生和卵细胞生成。例如,其对胚胎干细胞的分化调节主要通过DR0位点靶向抑制多能性基因Oct4来实现。小鼠实验表明,Nr6a1通过抑制线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶的表达参与调节睾丸能量代谢,提示其可能与细胞代谢行为相关。为了探讨NR6A1在肿瘤细胞代谢中的作用及机制,本研究以人睾丸畸胎瘤细胞Ntera-2为研究材料,开展了如下四个方面的工作:1、NR6A1对Ntera-2细胞糖代谢的影响在Ntera-2细胞中,分别RNA干扰敲低NR6A1的表达和转染NR6A1质粒进行过表达,随后检测Ntera-2细胞的代谢相关指标,如细胞葡萄糖摄入和乳酸产生等。结果发现敲低NR6A1促进Ntera-2细胞的葡萄糖摄取和ATP水平,但乳酸产生受到抑制,而对ROS含量无明显影响;NR6A1的过表达则抑制了Ntera-2细胞的葡萄糖摄取和ATP水平,促进了乳酸产生,对ROS无变化。2、NR6A1对代谢相关基因的调节作用通过生物信息学软件分析了148个代谢相关基因启动子上是否含有NR6A1结合位点DR0元件,最终预测启动子上含有DR0元件的代谢基因有12个。在Ntera-2细胞中分别通过RNA干扰NR6A1和过表达NR6A1,经qPCR实验发现NR6A1抑制GOT2,HK1和HK2的表达。Western blot实验进一步验证发现NR6A1蛋白敲低后,GOT2和HK1表达显著上调。结果表明NR6A1对GOT2和HK1发挥抑制作用。3、NR6A1对GOT2,HK1和HK2的直接靶向抑制作用分别构建了GOT2,HK1和HK2启动子荧光素酶报告基因载体,通过报告基因实验分析NR6A1对GOT2,HK1和HK2启动子活性的影响。结果表明,相比于pcDNA3.1组,pcDNA3.1-NR6A1实验组的GOT2,HK1和HK2启动子荧光素酶活性显著下调。随后通过染色质免疫沉淀实验,进一步证实了NR6A1直接靶向抑制GOT2,HK1和HK2。4、NR6A1通过抑制靶基因GOT2参与调节细胞糖代谢在Ntera-2细胞中分别转染GOT2、NR6A1表达质粒,将GOT2和NR6A1过表达,随后检测Ntera-2细胞的葡萄糖摄取量、乳酸产量、ATP水平以及ROS含量,观察GOT2过表达实验组与NR6A1过表达实验组对代谢水平的影响是否具有互反关系。实验结果发现相比于pcDNA3.1对照组,pcDNA3.1-GOT2过表达实验组葡萄糖摄取和ATP水平显著上调,乳酸产生显著下调,与NR6A1过表达结果存在互反关系。通过功能回补实验,即将GOT2质粒和NR6A1质粒共转染到Ntera-2细胞中,检测Ntera-2细胞的乳酸产量、葡萄糖摄取量、ATP与ROS水平,发现GOT2过表达可以减轻NR6A1对Ntera-2细胞糖酵解的抑制,而对细胞ATP水平抑制的缓解无明显效应。结果表明GOT2是NR6A1抑制Ntera-2细胞糖酵解过程的下游功能靶基因。综上,本研究初步证实了NR6A1通过直接靶向GOT2的表达抑制肿瘤细胞糖代谢,从而参与调节肿瘤的发生发展。