目的:不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenzaeNTHi)是一类没有荚膜的革兰阴性杆菌，常寄居于人类上呼吸道，存在于多达80％健康儿童和40％健康成人的咽部，作为条件致病菌，常导致呼吸道反复感染及引发中耳炎和鼻窦炎等疾病，成为目前儿童细菌性感染的主要病原体之一，因此，开发研制预防NTHi感染的安全有效疫苗显得尤为重要。由于NTHi没有荚膜多糖，所以挑选具有良好免疫原性的蛋白抗原已成为研究NTHi疫苗的焦点。研究表明，在所有流感嗜血杆菌菌株中（包括可分型和不可分型流感嗜血杆菌）高度保守的外膜蛋白P6(outermembrane protein P6，P6)可以诱导机体产生保护性的体液免疫、细胞免疫，但菌体内P6蛋白含量很低并且提取过程复杂，限制了对其进一步的研究。本研究的目的是:通过基因工程技术构建外膜蛋白P6原核表达载体，获得重组外膜蛋白P6，经腹腔注射和滴鼻途径免疫小鼠，评价重组P6蛋白的免疫原性，以确定重组P6蛋白在NTHi疫苗研制中的应用价值。　　 方法:以NTHi全基因组为模板通过PCR扩增获得P6目的基因，将P6基因克隆于PGEX-6P2载体，构建重组质粒PGEX-6P2/P6，并通过菌落PCR、酶切分析、基因测序的方法对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化入E.coli XL-Blue，用IPTG进行诱导，使P6蛋白在大肠杆菌中得以表达，利用表达的融合蛋白带有的GST（glutathione S-transferase，GST）标签，通过GST亲和层析完成P6蛋白的纯化，并经SDS-PAGE电泳分析确认;将纯化的GST-P6蛋白经腹腔注射或滴鼻两种方式免疫7～8周龄BALB/c小鼠，分别于第0天、14天、28天对小鼠进行三次免疫，末次免疫后14天，取小鼠血、脾和肺灌洗液标本，Western blotting检测血清P6蛋白抗体特异性，间接ELISA法检测血清及肺洗液中抗体IgG和IgA的水平，ELISA法分析其脾淋巴细胞IL-4，IL-10，IL-17和IFN-γ的产生水平。　　 结果:通过PCR从NTHiDNA模板中扩增出P6蛋白基因，扩增产物为462bp;成功构建了重组表达载体PGEX-6P2/P6，经PCR、BamHⅠ和NotⅠ双酶切分析、以及DNA序列测定，均证实插入的基因片段为P6蛋白基因;重组质粒PGEX-6P2/P6成功转入E.coli XL-Blue，P6蛋白得到大量表达，经GST亲和层析分离纯化，SDS-PAGE分析表明在42kDa处有特异性条带，表明纯化得到了目的蛋白P6;免疫动物后采集标本检测，间接ELISA结果表明重组P6蛋白通过滴鼻和腹腔注射均能刺激小鼠产生IgG，与腹腔注射相比，滴鼻途径能诱导肺粘膜产生较高的特异性IgA抗体。WB结果显示重组蛋白组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带出现，对照组不出现。检测小鼠脾淋巴细胞所产生的IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的水平(pg/ml)，滴鼻免疫组分别为77.76±15.94、196.24±45.94、21.87±9.84、374.10±65.34，滴鼻免疫对照组为24.15±11.32、49.27±15.12、5.27±1.66、100.33±24.18，腹腔注射组分别为67.45±13.38、60.91±11.14、5.80±1.87、109.24±23.12，腹腔注射对照组为27.67±9.13、48.38±13.56、5.75±1.79、96.75±20.89;滴鼻免疫组4项因子水平显著高于对照组(P＜0.01)。腹腔免疫组除IL-4显著高于对照组(P＜0.01)，其他3项因子水平与对照组无差异（P＞0.05）。滴鼻免疫组除IL-4外其他显著高于腹腔免疫组(P＜0.01)。　　 结论:本研究成功构建了P6蛋白的原核表达载体PGEX-6P2/P6，并在E.coli XL-Blue中大量表达，重组P6蛋白具有良好的免疫原性，经腹腔免疫主要诱导体液免疫，经粘膜免疫可以同时诱导产生体液免疫和细胞免疫。本研究为P6蛋白疫苗的研发提供了理论基础。