弗洛克豪斯病毒Flock House virus, FHV)最早发现于新西兰北岛弗洛克豪斯的一个农场,从罹病的新西兰草金黾体内分离得到。FHV隶属于野田村病毒科a属野田村病毒亚科。其病毒粒子无囊膜包裹,呈正二十面体,其基因组由两条单链正义RNA组成,是单链正义RNA病毒。FHV的基因组一共有4507个碱基,是已知的基因组最小的动物病毒之一。拥有着最小的,结构简洁的的基因组,并且可以在各种细胞中大量的高效的复制的特点,这使得FHV成为了研究各种RNA病毒基础理论的一个系统平台,如RNA的复制,基因组的特异性包装,病毒粒子的三维结构,病毒粒子的组装成熟等。RNA1包含了一个大的开放阅读框(ORF),用于翻译protein A (112kD), protein A作为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)被用来扩增病毒的基因组RAN1和RNA2以及亚基因组RNA3。序列比对发现,protein A的513-752aa含有八个RNA依赖的RNA聚合酶保守结构基序中的六个,其中一个是经典聚合酶活性位点基序GDD。在现有的研究中,虽然对于FHV病毒基因组复制的研究很多,但由于protein A蛋白自身的性质——N端疏水性很强,蛋白偏大——导致对于其复制的研究大部分是在体内环境下进行的,这样就无法排除细胞内源性蛋白对于病毒基因组复制起始的干扰。由于体内环境的限制,就目前的研究进展来看,FHV病毒基因组的复制起始方式还不清楚,位于基因组上的复制起始元件也只有初步的了解。为了确定protein A的RdRp活性及其起始病毒基因组复制的机制,我们利用大肠杆菌原核表达系统表达了FHV的protein A蛋白,为了得到可溶蛋白,我们在其N端加了MBP标签,经亲和纯化得到MBP-ProtA,同时我们在GDD保守位点引入了突变,表达纯化后获得突变体蛋白MBP-mProtA。分别以RNA1正负链的3’末端序列(+)1-191、(-)1-201作为模板底物,通过Northern blot、放射自显影、RT-PCR分析等方法,研究了proteinA起始FHV RNA1复制的方式。研究结果表明,proteinA通过非引物依赖的从头合成的方式起始FHV RNA1的复制的。以(-)1-201为模板底物,我们发现了最适反应条件：在30℃, pH8.0,1.0MmMn2+的情况,MBP-ProtA蛋白的RdRp活性最好,其中Mn2+是必须的,Mg2+不能代替Mn2+。我们还发现protein A除了具有RdRp活性还具有末端转移酶(TNTase)的活性,可以催化Digoxingenin-11-UTP结合到RNA底物分子的3’羟基端。我们还研究了RNA13’末端序列对复制起始的影响。结果表明,正链模板缺失了3’末端14-30个碱基时,复制效率大大降低,缺失了50个碱基时,复制几乎检测不到：负链模板缺失了3’末端2个碱基的时候,复制效率降低至70%,缺失3个碱基时,就不能进行复制了；负链模板3’末端3位的A突变成其他碱基对复制的影响不大；但如果对负链模板3’末端3位进行点突变,同时缺失末端2个碱基时,3种突变体模板对复制的影响就有明显的区别。同时我们用负链缺失型模板检测了MBP-Prot A的TNTase活性,结果表明,负链模板缺失了3’末端1-3个碱基的时候,TNTase活性正常,甚至比以正常的负链模板为底物时更高；负链模板缺失了3’末端4个碱基的时候,TNTase活性就几乎检测不到。但是本来几乎不支持复制的底物模板——(04-201、(-)A3U-201,经过MBP-ProtA的TNTase活性修复后,就可以成为MBP-Prot A进行RdRp的有效模板。这表明,protein A可以通过TNTase活性保护、修复病毒基因组的3’末端序列,从而保护病毒基因组的复制。