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IL-17是自身免疫性疾病的早期炎症因子,能够通过促进多种趋化因子的表达诱导疾病的进一步发展。单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein1,MCP-1)是一种常见的趋化因子,可以诱导单个核细胞在病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)心肌细胞中的浸润,我们前期研究发现IL-17和MCP-1在VMC心肌细胞的损伤中起重要作用,且IL-17能够通过上调MCP-1的表达而加重心肌细胞的损伤,但关于IL-17是通过什么信号途径诱导MCP-1的表达的目前还不清楚。NF-κB是调控炎症反应的重要核转录因子,广泛存在于多种信号传导通路中。有研究报道,多种细胞中IL-17能诱导NF-κB的激活,同时在某些细胞中激活的NF-κB能诱导MCP-1的表达。然而,在心肌细胞中,IL-17是否通过转录因子NF-κB的激活而上调MCP-1的表达,目前尚未见文献报道。我们通过TFSearch软件预测MCP-1启动序列中的存在的转录因子结合位点,发现MCP-1启动序列中存在NF-κB结合位点,基于以上认识和我们前期的研究,预测IL-17可能通过激活NF-κB上调MCP-1的表达,从而参与VMC的发生发展。目的研究NF-κB p65在IL-17诱导MCP-1表达增高中的影响作用,为病毒性心肌炎的治疗提供新的靶点。方法1.差速贴壁法分离balb/c小鼠心肌细胞,并进行心肌细胞原代培养。2.设计合成三对针对小鼠mcp-1启动序列中nf-κbp65的sirna和阴性对照sirna,实时荧光定量pcr(qpcr)筛选出干扰效率最高的干扰序列和最适干扰浓度。3.westernblot检测il-17(50ng/ml)作用不同时间后磷酸化p65(p-p65)和p65蛋白含量。4.qpcr分析p65sirna转染后il-17作用下mcp-1mrna的含量变化。5.酶联免疫吸附法(elisa)分析p65sirna转染后il-17诱导下mcp-1蛋白的含量变化。6.采用spss17.0软件进行数据统计分析,用单因素方差进行组间比较,两组间比较用lsd-t,检验水准为α=0.05。结果1.il-17作用下心肌细胞中nf-κbp65和p-p65含量分析。il-17作用小鼠心肌细胞5min、15min、30min后,各时间点心肌细胞中p65蛋白含量均无明显变化(p>0.05),而p-p65蛋白含量从il-17作用后逐渐增加,至15min达到峰值(p<0.05),随后逐渐下降,到30min时p-p65蛋白水平与对照组无明显差异(p>0.05)。2.nf-κbp65sirna序列的筛选。转染p65sirna-1、p65sirna-2、p65sirna-3组与转染阴性对照sirna组比较,p65含量都有不同程度的下降(p<0.01),但转染p65sirna-2组的p65mrna下降最明显,说明p65sirna-2干扰效率最高,因此后续试验将采用此序列作为干扰序列。3.nf-κbp65sirna最适干扰浓度的筛选。转染终浓度为5nm、10nm、20nm、50nm的p65sirna-2组与转染阴性对照sirna组相比,各浓度组p65mrna含量都有不同程度的下降(p<0.05),但转染终浓度为10nm时p65mrna下降最明显,说明此浓度为最适干扰浓度,因此后续试验将采用此浓度作为干扰浓度。4.nf-κbp65在il-17诱导mcp-1mrna表达中的作用。转染阴性对照sirna组与空白对照组比较,mcp-1mrna表达水平无明显变化(p>0.05);转染p65 siRNA-2组与转染阴性对照siRNA组比较,MCP-1 mRNA表达明显下降(P<0.05);转染阴性对照siRNA+IL-17组与转染阴性对照siRNA组比较,MCP-1 mRNA表达水平明显增加(P<0.05);转染P65 si RNA-2+IL17组与转染阴性对照siRNA+IL-17组比较MCP-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。5.NF-κB p65在IL-17诱导MCP-1蛋白表达中的作用。转染阴性对照siRNA组与空白对照组比较,MCP-1蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);转染p65 siRNA-2组与转染阴性对照siRNA组比较,MCP-1蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);转染阴性对照siRNA+IL-17组与转染阴性对照siRNA组比较,MCP-1蛋白表达水平明显增加(P<0.05);转染P65siRNA-2+IL17组与转染阴性对照si RNA+IL-17组比较MCP-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论1.IL-17可以通过诱导NF-κB p65磷酸化来上调MCP-1的表达。2.抑制NF-κB能有效抑制IL-17对MCP-1的上调作用。