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目的:暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是一种由多种原因引起的肝细胞急性大量坏死和严重肝功能损伤所致的临床综合征。大量研究资料表明,细胞凋亡、氧自由基的大量产生、细胞因子网络的激活以及凝血酶连锁反应的激活在肝细胞炎症坏死中发挥重要作用,导致暴发性肝衰竭的发生。但其确切的发生机制尚不十分清楚,严重制约着治疗的进展,使其病死率居高不下。目前的研究认为,在肝衰竭发生大块肝细胞死亡的病理过程中,除了肝细胞坏死这一死亡形式外,肝细胞凋亡在肝衰竭病理形成过程中也起着重要的作用。因此,研究和探讨暴发性肝衰竭肝细胞凋亡的发病机制是预防和治疗暴发性肝衰竭的关键。FADD (Fas associated death domain protein)介导着多种死亡受体诱导的细胞凋亡信号传导通路,起着承上启下的桥梁作用,是细胞凋亡的中转站。FADD为一胞浆适配子蛋白,是一些死亡受体如TNF受体超家族成员Fas(APO-1/CD95/ FasL receptor)、TNFR-1(Tumor necrosis factor receptor type 1)、DR3 (death receptor 3)、DR4 (death receptor 4)、DR5 (death receptor 5)和神经营养因子受体p75(p75 neurotrophin recap -tor ,p75NTR)介导凋亡的必需蛋白。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及其受体TNF-R1与Fas、caspase-8、TRAIL(TNF-related apop -tosis inducing ligand)均是介导凋亡的重要因子,Fas、TNFR1和TRAIL将FADD作为共同的下游信号传递体。而被联结的FADD可进行寡聚化从而激活caspase8(FADD样白细胞介素-1β转换酶, FLICE/MACH1/ Mch5)前体,caspase-8前体经过加工,以活性形式从DISC(death-inducing signaling complex,DISC)中释放出来,进而使其他caspase (caspase-3、caspase-6和cas -pase-7等)前体裂解为活性亚单位,激活caspases级联反应,最终导致细胞凋亡。已有研究证实,FADD所介导的肝细胞凋亡参与了暴发性肝衰竭、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精脂肪性肝炎、肝癌、肝硬化等多种肝脏疾病的病理生理过程。但FADD在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡信号转导通路中的具体作用机制及调控因素尚不清楚。本研究采用D-氨基半乳糖(D- galactosamine, D-GalN)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)制造大鼠暴发性肝衰竭模型,动态观察暴发性肝衰竭的肝细胞凋亡情况,探讨细胞凋亡在暴发性肝衰竭中的作用。通过动态观察肝组织中FADD及其介导的信号转导通路相关标志物的表达情况,探讨FADD及其介导信号转导通路在实验性暴发性肝衰竭中的作用。通过分析FADD及其凋亡通路相关指标(TNF-α、TNFR-1、caspase8)与细胞凋亡率的相互关系,探讨FADD在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡信号转导通路中的作用机制及调控因素。为今后临床通过调控肝细胞凋亡预防和治疗暴发性肝衰竭提供理论依据,为肝衰竭的基因治疗开辟新的途径。方法:1研究对象:雄性清洁级Wistar大鼠60只,体重180 -200g。将大鼠随机分为模型组30只,正常对照组30只。模型组腹腔注射D-GalN800mg/kg,之后立即皮下注射LPS10μg/kg,制造暴发性肝衰竭模型。对照组腹腔及皮下各注射2ml生理盐水。2标本的采集和保存:分别于注药(D- GalN +LPS)和生理盐水后,2,4,8,12,24小时行股静脉放血处死,各时间点取大鼠模型组6只,对照组6只。留取血清,放血处死后立即剖腹取肝脏,取适量肝组织经10%中性甲醛溶液固定,余经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。3肝组织标本采用常规HE染色:光镜下观察肝脏病理学改变。4采用免疫组化pv法,检测两组肝组织标本FADD、TNF-α、TNF-R1和caspase-8的蛋白表达。5用半定量反转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法研究FADD、TNF-α、TNF-R1和caspase-8在两组肝组织中mRNA的表达情况。6应用流式细胞学技术测定肝组织细胞凋亡率(apoptotic rate, AR),进行分析比较。7统计学方法:所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料均以x±S表示,采用秩和检验和Spearman秩相关分析对数据进行统计,以α=0.05为检验水准。结果:1两组大鼠一般状况观察:模型组随着给药时间的延长,大鼠一般状况逐渐恶化,依次出现活动减少,饮水减少,毛发竖立,精神萎靡,嗜睡等。对照组各时间点大鼠均处于正常状态。2两组大鼠肝脏大体标本观察:模型组肝脏随给药时间延长出现充血、出血点、直至大块淤斑及坏死,肝脏边缘较钝。对照组各时间点肝脏无充血、出血点、淤斑及坏死。肝脏边缘锐利,颜色红润、质地柔软。3两组肝组织病理HE染色:模型组随着给药时间延长,肝组织发生的病理改变逐渐加重,依次出现肝细胞水肿,炎细胞浸润,嗜酸性变,凋亡小体,直至大片出血,肝细胞坏死融合,核溶解、碎裂,纤维网状结构塌陷。对照组大鼠肝脏组织显示肝小叶结构清晰,肝小叶以中央静脉为中心,肝细胞索呈放射状排列,肝血窦清晰。4两组肝组织FADD蛋白及mRNA表达变化FADD蛋白表达:模型组随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多,12小时表达呈强阳性,随着肝细胞坏死的加重24小时阳性细胞数表达减少,各时间点表达有统计学意义(χ2=15.845,P=0.003)。对照组肝细胞胞质无明显FADD表达,各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组4、8、12、24小时FADD蛋白表达与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。FADDmRNA表达:模型组FADDmRNA随给药时间延长表达增加,12小时达高峰,以后下降(χ2=23.987, p=0.000)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组4、8、12、24小时FADDmRNA表达与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。5两组肝组织TNF-α蛋白及mRNA表达变化TNF-α蛋白表达:模型组随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多, 12小时表达呈强阳性,24小时表达减少,各时间点表达有统计学意义(χ2=18.427,P=0.001)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组2、4、8、12、24小时TNF-α蛋白表达与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-αmRNA表达:模型组TNF-αmRNA随给药时间延长表达增加,12小时升高最明显,24小时有所下降,各时间点表达有统计学意义(χ2=15.910, P=0.003)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组2、4、8、12、24小时TNF-αmRNA表达与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。6两组肝组织TNF-R1蛋白及mRNA表达变化TNF-R1蛋白表达:模型组随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多,12小时呈强阳性表达, 24小时阳性表达的细胞数有所下降,差异具有显著统计学意义(χ2=23.182, p=0.000)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组4、8、12、24小时TNF-R1蛋白表达与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-R1mRNA表达:模型组TNF-R1mRNA随给药时间延长表达增加,12小时升高最明显, 24小时有所下降,各时间点表达有统计学意义(χ2=23.659,P=0.000)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组TNF-R1mRNA表达4、8、12、24小时与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。7两组肝组织caspase-8蛋白及mRNA表达变化Caspase-8蛋白表达:模型组随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多,12小时呈强阳性表达, 24小时阳性表达的细胞数有所下降,各时间点表达有统计学意义(χ2 =23.621, p=0.000)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组4、8、12、24小时caspase-8蛋白表达与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。Caspase-8mRNA表达:模型组caspase-8mRNA随给药时间延长表达增加,12小时升高最明显, 24小时有所下降,各时间点表达有统计学意义(χ2=23.709,P=0.000)。对照组各时间点比较无统计学意义(P>0.05)。模型组caspase-8mRNA表达4、8、12、24小时与对照组同一时间点比较,明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。8两组大鼠肝组织细胞凋亡的变化流式细胞学检测凋亡率结果显示:模型组大鼠肝组织凋亡率随着给药时间的延长呈上升趋势,其中12小时凋亡达到最高峰,各时间点表达有统计学意义(χ2=25.475, P=0.000)。对照组各时间点凋亡率基本相似,除2小时外其它各时间点均较模型组低,差异具有统计学意义(p=0.004)。9 FADD、TNF-α表达与细胞凋亡率相关性分析:相关性分析结果表明,FADD、TNF-α表达与细胞凋亡率呈正相关(r=0.775、0.736,p=0.000、0.000)。10 FADD与TNF-α、TNFR-1、caspase8相关性分析:相关性分析结果表明,FADD与TNF-α、TNFR-1、caspase8呈正相关(r=0.566、0.896、0.784,p=0.001、0.000、0.000)。结论:1.利用D-GalN联合LPS制造暴发性肝衰竭大鼠模型,动态观察实验性暴发性肝衰竭的肝细胞凋亡情况,从形态学和细胞学方面证实肝细胞凋亡在暴发性肝衰竭发病机制中具有重要的作用。2.暴发性肝衰竭肝组织中FADD、TNF-α、TNFR-1和caspase8表达增加,并与肝细胞坏死程度和肝细胞凋亡密切相关。提示FADD、TNF-α、TNFR-1和caspase8参与了暴发性肝衰竭的发病过程。3.暴发性肝衰竭肝组织中FADD与TNF-α、TNFR-1、caspase8,肝细胞凋亡率密切相关,从细胞、蛋白和基因水平证实FADD及其介导的信号转导通路在实验性暴发性肝衰竭肝细胞凋亡的发病机制中起着重要的调控作用。科学有效地调控FADD的表达,可以阻止FHF的发生。