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P53是一种重要的抑癌基因，当细胞遭受损伤因素作用时，P53活化并激活一系列基因，构成“P53网络”，在细胞周期中发挥校正点功能，阻止损伤的DNA进行错配修复，从而防止细胞发生癌变。MDM2、P21是P53的下游基因，是“P53网络”重要的成员，与P53活性调节及其作用的正常发挥关系密切。p53变异或失活是肿瘤发生发展的重要分子事件。在人类原发性肝癌中，也普遍存在P53功能的丧失，而且由于HBV感染与原发性肝癌的密切相关性，HBV与P53的关系问题一直也是人们研究的热点之一。本研究在P53、HBV状态不同的几种肝癌细胞中检测了P53活性并观察了MDM2/P53/P21三种蛋白表达；观察了P53与细胞DNA切除损伤修复能力的关系；HBV以及HBV增强子Ⅰ上游P53样应答元件结合序列与P53的相互作用关系。主要见以下几个部分。 一、不同肝癌细胞系中P53/P21/MDM2表达及与HBV关系分析 选用背景状态不同的几种肝癌细胞系；HepG2、HepG2．2.15、PLC/PRF/5、HCC-9204、Hep3B，目前已知各细胞内P53状态以及细胞内HBV复制或整合的情况不同。首先用Western blot方法比较了几种细胞系中P53、P21、MDM2蛋白表达量的不同，并通过检测报告基因PG13-CAT、P21-LUC在细胞内的表达观察P53活性以及P53对P21启动子作用的差异。结果表明，PLC/PRF/5细胞具有较高水平的P53蛋白表达，但报告基因PG-13CAT转染细胞后，CAT酶为低表达，这可能由于该细胞中P53蛋白为变异形式，P53半衰期延长造成蛋白表达量增高，反式活化功能却降低或丧失；细胞中P21蛋白存在一定水平的表达，而且报告基因P21-LUC转染细胞后，荧光素酶报告基因也高表达，说明PLC/PRF/5细胞中存第二军医大学博士学位论文中文摘要在不依赖于P53的途径对PZI的活化表达具有促进作用;而在H即3B细胞，由于P53全基因缺失，细胞中无P53蛋白表达，P21蛋白以及P21一LUC报告基因处于相对较低水平:HCC一9204细胞中存在低水平的P53与PZI蛋白表达:与HepGZ细胞相比，HepG2.2.巧较H即G2具有较高的P53、PZI蛋白表达，而且报告基因PG13一以T、P21一LUC在H即G2.2.15细胞中表达均高于H即G2细胞，考虑这可能与细胞中HBV的复制有关。HBv在细胞内的复制可能通过P53依赖或非依赖的途径对P21具有促进作用。 从MDMZ的表达情况来看，发现MDMZ与P53的表达具有相反的趋势:在姗M2表达偏低的细胞，P53表达偏高，如PLC/PRF/5，HepGZ(HepG2.2.15)细胞;而在MDMZ高表达的HCC一9204、H即3B细胞，P53表达偏低或无表达。说明MDMZ对于野生型或变异型P53可能都具有降解作用。 选用HepGZ、Hepe2.2.15、Hep3B、PLe/pRF/5四种肝癌细胞系。分别给予一定剂量的紫外线照射，Western blot方法检测P53蛋白表达的改变，用‘H掺入法通过检测细胞的程序外DNA合成，观察各细胞DNA切除损伤修复能力。结果发现，PLC/PRF/5细胞在紫外线照射前后P53蛋白表达没有明显改变;H即3B细胞照射前后P53蛋白均无表达:在H即G2、H即G2.2.15细胞，发现紫外线照射后的P53蛋白表达明显增强。HePGZ、H即G2.2.15细胞对紫外线诱导的DNA损伤修复能力明显高于pLc于R卫/5、HeP3B细胞。说明在具有P53活性表达的细胞，紫外线照射可以通过活化细胞内P53，促进细胞的DNA损伤修复，帮助细胞度过损伤。HepGZ细胞的DNA切除损伤修复能力相对强于H即G2.2.15细胞，这可能与HePG2.2.15细胞中HBV的复制有关，提示HBv通过干扰损伤DNA修复，而与肝癌的发生有关。二、HBv与P53作用关系初步研究 在上面实验中，发现HePG2.2.15细胞中P53活性以及P53于21表达较HepGZ明显增高，本实验进一步比较了HePGZ与HepG2.2.15细胞生物学活性以及成瘤性，并在7721肝癌细胞系中，通过细胞内转染HBV与P53质粒，观察了HBV对P53活性、蛋白表达以及对P53下游基因PZI基因启动子的影响，以及P53对HBV病毒复制的作用，并观察了二者作用对细胞凋亡的影响。结果显示，HePG2.2.巧细胞的增殖与凋亡特性均强于H即G2细胞，并且具有成瘤性。7721第二军医大学博士学位论文中文摘要细胞内转染HBV质粒具有增强P53蛋白表达以及P53功能的作用，使P53对PZI基因启动子的激活作用进一步增强，细胞凋亡率明显增加，细胞生长抑制。这说明HBv在细胞内复制对细胞的凋亡与增值均具有增强作用，二者处于对抗平衡的作用，感染早期，细胞凋亡占优势，而当细胞的增殖占优势时，就会生成肿瘤。 荧光定量PCR方法检测HBv质粒细胞内转染后HBv的复制情况，发现细胞内P53的表达对HBv的复制也具有一定的促进作用。三、P53与HBv增强子I上游P53样应答元件结合序列关系研究 前期工作中发现，在HBv基因组增强子I上游存在P53样应答元件结合序列，TGCC(G)T.··…TGCCT，体外实验发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性结合;在以上的实验中，也发现P53对HBv的复制具有一定的促进作用(野生型P53的反式激活作用需依赖于其与DNA序列的特异结合)。本实验进一步观察了P53与HBV基因组上P53样应答元件结合序列之间的作用关系:报告基因质粒PX一以T上含有HBV的这段DNA序列，首先