随着现代药物发现技术的发展,涌现出许多新的候选药物,目前,新开发的具有药理活性的化学成分中40%以上具有脂溶性,其水溶性很差。因此,尽管这些物质药理活性很高,但由于其口服生物可利用度低,从而限制其进一步的研究和应用。如何将这些物质制备成具有高效生物可利用度的口服药物成为药学科学家面临的挑战之一。针对此难题,目前研究热点是构造基于油脂的药物输送体系,控制脂溶性分子的消化和吸收,从而提高亲脂性药物的口服生物可利用度。基于油脂的药物输送体系包括油溶液,油悬浮液,乳液,微乳,自乳化剂,干乳剂等。乳液作为其中的一种,近年来成功地提高一些免疫抑制药物的生物可利用度。乳液一般由至少两个不相容的液体组成(通常是油和水),一种液体能以液滴的形式分散在另一种液体中。在食品工业中,乳液科学与技术已经被广泛应用,包括大量的天然和加工食品,譬如牛奶,奶酪,咖啡乳化剂,软饮料,水果饮料以及婴儿配方奶粉等。而作为药物输送体系,乳液具有独特的优势,可采用多种廉价的食品级材料(如油脂,蛋白质,多糖,表面活性剂,矿物质)作为原料,价格便宜,并且加工方法(如混合,均质化,热处理)简单,使乳液体系易于制备。采用安全无害的乳液输送体系,能够包裹、保护和释放食品和药物中具有功能性和生物活性的脂溶性组分,从而在胃肠道中定位输送生物活性组份,控制油脂的生物可利用度,譬如延缓食品中油脂消化进而产生饱腹感。研究报道,很多基于乳液的油脂输送体系被食品和其他工业用作可食用输送体系,包括传统乳液,纳米乳液,多层乳液,固体油脂颗粒,填充水凝胶颗粒等,可见乳液技术尤其适合用作油脂的输送体系。本课题针对结肠癌,结合食品和药学领域创新性提出了以潜在的抗结肠癌药剂三丁酸甘油酯为模型药物的一系列乳液输送体系。由于目前已有的多种抗结肠癌药物及具有潜在抗癌作用的药物,大部分水溶性较差,在胃肠道中容易被酶水解,转化为小分子,进入血液循环,从而不能定位到达大肠,导致在实际应用中药物的抗癌活性并不能被人体有效利用。譬如,潜在的抗结肠癌药剂三丁酸甘油酯由于很容易被酶水解,到达不了结肠而不能发挥抗癌药效,目前对此研究很少,主要局限于通过细胞实验验证其抗癌性,而利用本课题研究的乳液输送系统,抑制了三丁酸甘油酯在胃肠中的酶水解,从而定位至结肠发挥抗癌作用。因此,本论文的研究目标在于构建一系列基于乳液的结肠癌药物定位输送体系,抑制脂溶性药物在胃肠道的消化水解过程。研究内容则包括采用天然油脂,食品级乳化剂,生物大分子(蛋白质和多糖)等原料构建基于乳液的结肠癌药物输送体系,探讨了用于控制油脂消化的每一种输送体系的结构、制备方法及其应用,并采用动、静态光散射(Dynamic light scattering, DLS; Static light scattering, SLS),激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)及体外消化模型表征乳液体系的结构,稳定性和消化能力。研究结果表明本论文中的乳液输送体系可以提高脂溶性药物的亲水性及其生物可利用度。因此,本课题的研究对于针对不同脂溶性药物,选择最适合的乳液输送体系有很重要的参考价值,所研制的体系可以用来包裹保护活性成分,控制油脂的消化过程,定位释放脂溶性药物,提高药物的生物利用度。同时,由于采用的原料均为食品级,此乳液输送体系也可应用于开发和研制具有药理活性的功能性食品。主要研究内容和结论：1.制备一种潜在的抗结肠癌药剂(三丁酸甘油酯)的乳液输送体系三丁酸甘油酯(TB)是一种可用作食品添加剂的短链甘油三酸酯油,也可作为一种潜在的抑制结肠癌的药剂。由于受到奥斯特瓦尔德成熟(Ostwald ripening, OR)过程的影响,以TB为油相的乳液极不稳定。但TB作为一种低分子量甘油三酸酯,具有相对高的水溶性,致使TB乳液稳定性很差。通过加入15-25%玉米油(一种食品级油,具有很低的水溶性),可以大大提高乳液对OR的稳定性。并且由于混合油(TB／玉米油)体系中,油和水之间的密度差减少,从而降低颗粒沉淀分层趋势。细胞培养实验结果表明了TB乳液具有潜在的抗癌能力,同时研究了各种乳化剂和油脂的细胞毒性。乳化剂的抑制癌细胞能力按以下顺序降低：吐温20(一种非离子型表面活性剂)>乳球蛋白和酪蛋白(两种牛奶蛋白)>卵磷脂(一种磷脂)。因此在解释细胞培养模型结果时,需要考虑乳化剂的细胞毒性的影响。经过TB乳液的处理,结肠癌HT-29细胞的生长明显被抑制。在TB浓度超过0.02 wt%(如：>0.7 mM),它能抑制细癌细胞(>50%死亡率)。研究结果对如何研制具有抗癌作用的功能性食品有很重要的应用价值。2.采用动态脂肪水解pH-stat方法建立和调试小肠体外消化模型人体胃肠内油脂消化的控制对功能食品和药物的生物利用度非常重要,因此可建立体外消化模型模拟体内油脂消化的过程。体外模型具有容易操作,可重复性高,低消费的优点,克服了动物实验花费时间长,费用高的缺点。目前动态脂肪水解实验(pH-stat)方法已经广泛用于表征油脂在模拟小肠条件的体外消化能力。同时提高基于油脂体系的组成和结构对脂溶性生物活性组分的消化和水解的理解和认识。这种方法是通过监测为维持pH在一个设定值所需的NaOH体积,来测量随着时间所释放的游离脂肪酸的量,故可用此模型评估构建乳液输送体系的油脂消化率。本文研究了产物组分及其微结构、消化液组分、添加剂(天然聚多糖)对油脂消化的影响。用pH-stat的方法研究了水包油乳液中各种实验参数对油脂消化的影响,表明油脂消化量和速度随下述因素变化而增加：酶浓度增加(0-5 mg／ml)；胆汁酸浓度降低(20-0 mg／ml)；CaCl2浓度增加(0-20 mg/ml)；油脂量减少(2.5-0.1%)；颗粒粒径减少(800-200 nm)；脂肪酸分子量的降低(中链甘油三酸酯和长链甘油三酸酯-玉米油)。这些影响与油脂暴露在水相中的表面积有关,也与影响反应产物在油水界面积累的因素有关。通过实验结果建立如下主要的体外消化模型参数：消化液体积37 ml,pH7.0,搅拌速度4 s-1,NaCl和CaCl2浓度分别为150 mM和10 mM,胆汁酸浓度20 mg／ml,胰脂肪酶浓度2.4mg／ml。油脂浓度,油脂颗粒粒径及滴定液NaOH浓度依具体实验而定。3.静电层层自组装构建生物高分子纳米层控制油脂消化前面内容证明乳液可以提高脂溶性药物的亲水性,但是单独的乳液不能提高脂溶性药物的生物可利用度。本章利用界面静电沉淀方法在油脂颗粒表面形成多组分生物高分子纳米层,旨在通过控制油脂的消化来提高脂溶性药物的生物可利用性。据以上目的制备了以下多层体系：β-乳球蛋白-壳聚糖-海藻酸／果胶；β-乳球蛋白-海藻酸-壳聚糖,酪蛋白-壳聚糖-果胶和酪蛋白-胶质-壳聚糖-果胶,即乳液先用蛋白质乳化剂(p-乳球蛋白,酪蛋白钠)稳定,然后在一定pH条件下包覆不同的多糖层。结果表明：多糖包覆层大大提高了蛋白质乳液的环境稳定性,并修饰乳液颗粒的界面电荷特性。初级乳液颗粒只有一层蛋白质包覆层,当pH从3增加到7时,颗粒由带正电荷变为带负电荷,而pH位于等电点附近,由于颗粒表面净电荷趋于零低,而发生聚集,导致乳液变得极不稳定。而乳液颗粒被多糖包覆之后,乳液对pH变化的稳定性则主要取决于纳米层中生物高分子的顺序及其特性。当壳聚糖为外层时,乳液在pH3-6稳定,但pH高于6.5时,则由于此条件下颗粒表面静电荷低而容易发生团聚,导致乳液不稳定。当海藻酸或果胶为外层时,乳液在pH4-7稳定,在pH3时,乳液会有少许聚集,因为在此条件下颗粒带低的静电荷,但是这种不稳定可以通过提高海藻酸和果胶多糖的浓度而得到改善。由此可见,生物活性脂溶性组分的消化和释放可以通过多层生物高分子层包覆油脂颗粒来控制。本文通过沉积海藻酸和壳聚糖在油脂颗粒表面制备了高达5个沉积层的层层自组乳液体系。粒径和电位结果表明在初始的几层时粒径会增加,然后趋于稳定。颗粒电荷在加入壳聚糖后会变成正电,在加入海藻酸后变成负电。其电荷值|ζ|能维持在～30 mV。进而研究了油脂颗粒表面纳米生物高分子层的结构组织对脂肪酶体外消化力的影响。结果表明多糖层仅仅能延缓油脂消化的速度,但不能完全阻止,同时油脂消化的控制取决于外层组分,消化液中Ca2+的浓度等。在相对低的钙离子浓度(5 mM CaCl2)时,油脂颗粒表面纳米生物高分子层对油脂消化的速率没有显著的影响,但是在高钙离子浓度(20 mM CaCl2)时,生物高分子层能降低其消化速率,延缓油脂的消化,90%油脂消化的时间从几分钟推迟到2 h以后。研究结果对如何控制脂溶组份在人体胃肠中的消化和释放有很重要的参考价值。对于海藻酸／壳聚糖多层纳米层,初步pH-stat结果表明当沉积层达到2个沉积层以上,油脂消化的速度和消化量开始明显地减少和阻止,2 h的消化量从约90%减少到50-60%。当添加更多层数,油脂消化量能减少至5-10%。减少量同时取决于油脂的组分。当油脂组分中短链甘油三酸酯含量增加时,需要更多的高分子纳米层来抑制油脂的消化。例如当高分子层数为3层,TB含量分别占油脂的50%和80%时,2 h后其消化量分别为～12%和～34%。4.离子交联法形成多糖和聚电解质凝聚复合层控制油脂消化采用三聚磷酸钠(TPP)交联壳聚糖作为油脂颗粒的包覆层。由于静电引力和颗粒间的交联,高浓度TPP(～0.004wt%)更能促进颗粒凝聚和重力分离。但低浓度TPP下,可以形成比较稳定的,纳米级交联壳聚糖包覆油脂颗粒(450nm,电荷≈+60 mV)。在pH值为3时,21天之后,交联乳液仍然保持稳定,没有出现凝聚和分离现象。但是在pH 7下,颗粒因为表面电荷降低,颗粒间静电斥力减弱而变得极不稳定。体外油脂消化模型(pH-stat)研究壳聚糖层对油脂消化的影响发现,壳聚糖交联后,油脂消化的速度有所降低。实际上在模拟小肠消化条件下,交联前后壳聚糖层都能一定程度上降低油脂消化。未包覆壳聚糖时,乳液很快被消化液中胰脂肪酶水解(～80%,10 min),包覆壳聚糖层后,消化速率减慢,1 h后油脂消化量约60%,壳聚糖层交联后,1 h后油脂消化量可以再次减少10%。研究结果对于设计构建乳液来控制消化,以定位释放脂溶性功能性组份到特定区域具有重要作用。本文通过直接法和间接法制备了包覆油脂的海藻酸／壳聚糖复合凝聚颗粒。直接法是将油脂乳液和海藻酸混合物直接滴加到CaCl2／壳聚糖混合液中制得所需颗粒。间接法则是将油脂乳液和海藻酸混合物先滴加到CaCl2溶液中,然后再将其滴加到壳聚糖溶液中。通过这两种方法制备了含有分散在海藻酸／壳聚糖复合凝聚体系中油脂粒的填充水凝胶颗粒。通过改变海藻酸(0.2-0.5%,w／v),壳聚糖(0.2-0.5%,w／v),CaCl2(0.02-0.05%,w／v)的浓度可以控制水凝胶颗粒的大小。利用体外消化模型监测了所得颗粒的油脂消化力。结果表明,颗粒结构和油脂消化率主要取决于多糖和CaC12的浓度及制备方法。在低浓度条件下,颗粒粒径较小(微米),颗粒体系对油脂消化没有太大影响(半小时内几乎100%油脂被消化),但在高浓度条件下,颗粒粒径较大(毫米),颗粒体系能大大延缓油脂的消化过程,100%油脂消化时间由几分钟延后到1 h以后。研究结果有利于通过对体系组份和制备过程的合理选择来控制油脂的消化速度和消化量。5.利用Ca-海藻酸凝胶珠控制油脂消化研发一种填充油脂颗粒的水凝胶珠,以控制油脂的消化和释放。当pH从1变到7时,凝胶珠仍然保持完整,但在低pH1-2时,凝胶珠出现明显压缩。在脂肪酶作用下,利用体外消化模型监测了水凝胶珠中游离脂肪酸的释放速率。包裹在珠中油脂在两小时后消化力从-100%降低到12%。研究了水凝胶珠的粒径大小,交联度,油脂类型对油脂消化力的影响。随着粒径减小,交联度降低,甘油三酸酯的分子量降低,油脂消化速度增加。对于粒径减小的水凝胶珠(3.37±0.21mm,2.37±0.16 mm,0.82±0.15mm),2小时后油脂消化量分别提高为11.3,11.8and 20.5%。当水凝胶珠中海藻酸浓度为0.25%,0.5%1.0%,2.0%时,2 h油脂消化量分别为84.1±9.2%,60.6±2.2%,30.6±1.1%,17.5±1.8%；当水凝胶珠中Ca2+浓度为0.5%,1.0%,2.0%5.0%,10.0%时,2 h后油脂消化量分别为50.0±0.8%,45.4±2.0%,26.4±8.4%,19.1±3.5%,16.9±1.2%。当甘油三酸酯为长链(CO)和中链(MCT)甘油酯时,2 h后油脂消化量低于10%,然而当甘油三酸酯含有50%短链(TB)甘油酯时,2 h后油脂消化量仍在35%左右。研究结果对于设计输送体系以保护、释放生物活性组份有重要应用。6.羧甲基壳聚糖／聚乙烯醇共混水凝胶的研制及其牛血清蛋白缓释性能研究通过冷热技术制备了羧甲基壳聚糖(CMCS)和聚乙烯醇(PVA)共混水凝胶,研究了水凝胶的凝胶程度,溶胀和pH响应行为,用红外光谱(FTIR)和扫描电镜(SEM)表征了该水凝胶的微观结构和形态。重量分析结果表明凝胶程度随冷热循环时间的增加而增加。相对于纯PVA水凝胶,CMCS的加入能明显改善共混凝胶的溶胀特性。当CMCS／PVA质量比80／20时,共混水凝胶具有最高的溶胀率。pH对溶胀率影响的结果表明pH在CMCS的等电点附近时,凝胶具有最低的溶胀率。以牛血清蛋白(BSA)为药物模型,研究了CMCS／PVA水凝胶的药物缓释性能。结果显示,水凝胶具有pH响应性,在pH为1.0的条件下释药慢,而在pH为7.4时释药快,可用于小肠或结肠定位缓释系统。CMCS的加入能改善纯PVA水凝胶的物理特性,提高其pH敏感性。因此,CMCS／PVA水凝胶很有潜力作为药物载体。