目的目前恶性胶质瘤是最为盛行的原发性脑瘤,传统的方法,如化疗,放疗难以从根本上对其进行治疗,但由于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内外均显示出很强的趋瘤性,所以BMSCs有望成为胶质瘤治疗的优选种子细胞。然而,关于分化的BMSCs细胞是否有同样的趋化性以及BMSCs向胶质瘤趋化性迁移机制研究的却很少,本研究旨在探讨成神经分化的BMSCs向胶质瘤分泌的趋化因子之一血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)的迁移行为及其分子机制。方法本实验分四部分进行研究,其中前三部分研究成神经分化的BMSCs向PDGF的迁移,最后一部分研究的是PDGF引起的BMSCs迁移的分子机制。各个部分内容具体为:(1)采用Percoll密度梯度离心法体外分离培养大鼠BMSCs,通过免疫组织化学染色和多向分化的方法对培养的细胞进行鉴定。(2)采用加入抗氧化剂的方法诱导BMSCs向神经样细胞分化,即先用10 ng/ml的bFGF预诱导24 h,再加入200μM的丁羟基茴香醚(BHA)和2%的二甲基亚砜(DMSO)诱导5 h,最后用含有10μl/ml N2的H-DMEM维持培养48 h。观察诱导分化过程中BMSCs的形态变化,通过免疫荧光染色检测诱导细胞的神经细胞特异性标志物nestin、β-III-tubulin和NSE的表达情况。(3)运用Dunn chamber研究成神经分化不同阶段BMSCs向胶质瘤分泌的因子之一PDGF的趋化性迁移。细胞的迁移通过德国Leica AF6000活细胞工作站拍摄得到图像,应用NIH Image J软件分析图像,每个状态随机抽取30个细胞进行统计得到细胞的迁移速率、迁移效率和单个细胞的迁移轨迹。(4) Rac1对PDGF诱导的BMSCs迁移行为的影响通过实时显微摄像系统进行研究,而PI3K信号通路对该趋化性迁移行为的作用通过实时显微摄像系统和Dunn chamber两种方法进行探索。两种方法均用德国Leica AF6000活细胞工作站拍摄得到图像,应用NIH Image J分析图像,每个状态随机抽取30个细胞进行统计得到细胞的迁移速率和效率。结果(1)采用Percoll密度梯度离心法成功分离培养出大鼠BMSCs,可稳定传至20代以上。免疫组织化学鉴定结果为CD29、CD90、CD106阳性,CD34阴性;多向性分化实验证明其既可以成骨分化又可以成脂分化,证实实验所培养的细胞具备BMSCs的基本特征。(2)用bFGF/BHA诱导BMSCs向神经样细胞分化,预诱导24 h,细胞胞体出现收缩,细胞边缘变得不规整;诱导5 h,细胞胞体进一步收缩,折光性增强,伸出细长的突起,并且多为两极突起,小部分细胞出现死亡并脱落;维持48 h细胞出现更多的分叉,并出现二级分叉;对照组细胞形态上则无显著性变化。免疫荧光染色结果显示诱导的细胞表达神经前体细胞标志物nestin,未成熟神经元标志β-III-tubulin和成熟神经元标志物NSE。(3) Dunn chamber分析显示,BMSCs能够趋化PDGF定向迁移,细胞的迁移速率和迁移效率均明显高于对照组,单个细胞迁移轨迹也证实了这一结果。成神经分化不同时期的细胞对PDGF的趋化能力不同:未诱导的BMSCs、预诱导24 h和诱导5 h的分化细胞的迁移速率得到明显提高,而未诱导的BMSCs、维持18 h和维持48 h的分化细胞的迁移效率显著升高。(4)实时显微摄像系统分析显示,提高Rac1的总量或者激活其表达水平会提高PDGF诱导的BMSCs的迁移速率,反之则会显著性的降低迁移速率,但对细胞的迁移效率均无显著性的影响;同时PI3K信号通路的抑制剂LY294002的加入会降低迁移速率,Dunn chamber获得同样的结果,说明Rac1和PI3K信号通路均参与PDGF诱导的BMSCs的迁移。结论BMSCs可以趋向PDGF迁移,其对PDGF的趋向性迁移与其分化状态密切相关,在此过程中有Rac1和PI3 K信号通路的参与。