枳(Poncirus trifoliata (L.)Raf.)是柑橘中最常用的砧木，具有优良的抗寒性和抗病性，但是，枳抗旱性和抗盐性相对较弱，影响了其在生产上的应用范围。研究表明，多倍体植物常常表现出更强的抗逆性，倍性育种可作为培育柑橘抗逆种质的重要手段。此外，基因工程作为生物技术的核心，也是培育抗逆种质的重要技术。因此，在枳中发掘多倍体资源，筛选重要的抗逆基因，对柑橘的生产和应用具有重要的意义。在此背景下，本研究首先从枳自然实生群体中筛选了一批同源四倍体材料，分析了其抗旱性和抗盐性，之后利用RNA-seq解析了四倍体枳的抗逆机理，并从中筛选了两个重要的胁迫响应基因研究了其功能。主要研究结果如下：
　　1.基于形态学初选，流式细胞仪和染色体计数验证，从约20000株枳的天然实生苗中筛选出75株四倍体枳，四倍体的发生率约为0.375%。通过全基因组SNP分析表明其均为同源四倍体。四倍体与二倍体相比植株矮，叶片增厚、变宽，下表皮气孔密度降低，细胞增大。干旱和盐处理后，通过观察四倍体和二倍体的表型并测定相关抗逆指标，发现四倍体抗旱性和抗盐性均显著强于二倍体。
　　2.为分析四倍体枳的抗旱机制，我们对处理前后的四倍体和二倍体叶片进行了转录组测序。对差异表达基因GO功能富集分析，表明四倍体在重要的胁迫响应通路上与二倍体存在明显不同，特别是抗氧化胁迫相关途径，一些相关基因只在四倍体中有富集。进一步分析四倍体与二倍体的抗氧化能力，发现抗氧化酶基因表达量、酶活性在四倍体中高于二倍体，与四倍体干旱下积累更少的活性氧一致。差异表达基因KEGG分析发现，淀粉和蔗糖代谢途径的基因在四倍体中明显富集。一个液泡蔗糖转化酶基因(VINV)受干旱诱导，在四倍体中的表达量高于二倍体，而四倍体蔗糖含量低于二倍体，葡萄糖含量高于二倍体。研究表明，四倍体枳抗旱性增强主要是通过提高活性氧清除及渗透调节能力来实现。
　　3.为揭示四倍体枳的抗盐机制，对盐处理前后二倍体和四倍体枳根和叶进行RNA-seq及转录组分析。对四倍体差异表达基因进行GO分析，结果表明盐胁迫下四倍体与二倍体中的差异表达基因很多与胁迫有关。KEGG分析发现，四倍体叶片与根差异表达基因富集在不同的代谢途径。叶片中的差异表达基因主要富集在激素信号转导途径，生长素、油菜素内酯、细胞分裂素和茉莉酸相关基因在四倍体中的表达量高于二倍体；此外，一个POD基因在四倍体中的表达量显著高于二倍体，使得四倍体叶具有更强的活性氧清除能力。根中的差异表达基因则以淀粉和蔗糖及脯氨酸代谢为主，同时发现盐胁迫下四倍体中积累更多的可溶性糖和脯氨酸。四倍体根中抗氧化酶基因APX显著上调表达，使根具有更强的活性氧清除能力。因此，四倍体叶和根中存在不同的防御机制协同作用使其抗盐性比二倍体强。
　　4.从干旱胁迫转录组数据中，我们筛选到一个LEA家族基因(PtrLEA7)并对其功能进行了研究。该基因CDS全长420bp，编码139个氨基酸，属于LEA_4亚族，定位于细胞质和细胞核中，其表达显著受脱水、低温和ABA的诱导。在烟草和枳中超表达该基因，获得了转基因植株。干旱胁迫处理后，转基因植株的抗旱性比野生型强，表明该基因正调控抗旱性。进一步研究发现，转基因植株中抗氧化酶基因表达量和CAT酶活性均高于野生型，活性氧含量低于野生型，表明该基因通过增强抗氧化能力来调控抗旱性。
　　5.从盐胁迫转录组数据中筛选到一个R2R3类MYB转录因子PtrMYB3，该基因CDS全长756bp，编码251个氨基酸，定位于细胞核中，具有转录活性。PtrMYB3表达受盐、脱水和低温等非生物胁迫的诱导。通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术在枳中将该基因沉默，发现枳沉默系的抗盐性显著强于野生型。进一步研究表明，沉默系中淀粉酶、果胶甲酯酶和过氧化物酶基因表达量显著高于野生型。LUC实验证明，PtrMYB3是POD转录抑制子，表明PtrMYB3可能抑制相关基因的表达来负调控抗盐性。