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柑橘类柠檬苦素是一种具有广泛生物学活性的四环三萜类物质，对人体有重要的保健作用。类柠檬苦素在柑橘果实和种子中的分布规律已有较多研究，但其生物合成的遗传调控机制鲜见报道。本研究基于不同柑橘品种叶片在不同发育时期类柠檬苦素含量的差异，对宽皮桔类、橙类、金柑、柚类品种进行类柠檬苦素含量表型的系统分析和评价，明确了柑橘品种和叶片不同发育时期的表型特征。并对前期获得的21个与柠檬苦素含量相关的候选基因的表达量进行了分析，阐明候选基因表达量与柠檬苦素含量之间的相关关系。对筛选出的重要候选基因CiMYB42通过遗传转化验证其对类柠檬苦素生物合成的影响，发现转基因CiMYB42对类柠檬苦素的含量产生了较大的影响，同时也明显改变了三萜类物质生物合成相关基因CiSQS和CiOSC的表达。随后，通过酵母单杂交验证了CiMYB42与CiSQS、CiOSC之间的相互作用，EMSA验证了与CiMYB42互作的靶标元件。利用RNA-Seq技术对CiMYB42转基因植株进行测序，深入解析了转基因CiMYB42对次生代谢途径所产生的影响。综合以上研究明确了CiMYB42对类柠檬苦素生物合成的调控机制。本研究主要结果如下：
(1)对九个不同柑橘品种三个不同发育时期叶片的类柠檬苦素的积累规律和21个候选基因的表达模式以及两者之间的关联性进行了分析，结果表明：总体来看，遗传背景的差异是影响类柠檬苦素含量差异的重要因素，不同类别柑橘品种类柠檬苦素的含量差异较大。九个品种的类柠檬苦素含量在0.02-0.53mg/g之间；柚类品种广西沙田柚和早熟暹罗蜜柚类柠檬苦素含量较高，在0.15-0.22mg/g之间，宽皮柑橘类品种盛田温州蜜柑、宫川温州蜜柑、旺苍皱皮柑类柠檬苦素含量较低，在0.04-0.08mg/g之间，而宽皮柑橘与柚类的杂交后代甜橙类含量最高，在0.25-0.53mg/g之间，金柑类含量最低，在0.02-0.05mg/g之间。另外，宽皮柑橘中的3个品种中，旺苍皱皮柑叶片中类柠檬苦素的含量最高，宫川温州蜜柑次之，盛田温州蜜柑最低，这可能与遗传背景有关。综上所述，不同类别柑橘品种叶片中类柠檬苦素的含量高低依次为甜橙类>柚类>宽皮柑橘类>金柑类。此外，在叶片发育过程中不同品种的类柠檬苦素含量变化呈现出了不同规律。21个候选基因的表达模式主要分为四个类群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，I类群只有ciclev10015042m，该基因在甜橙类和金柑类品种中高表达；Ⅱ类群包括ciclev10029650m、ciclev10021695m、ciclev10031065m、ciclev10012453m，这四个基因表达量范围接近，且都在柚类品种中高表达；Ⅲ类群包括ciclev10011386m、ciclev10007937m、ciclev10020010m、ciclev10000886m、ciclev10005233m，该类群中5个基因都在橙类品种中高表达。候选基因表达量与类柠檬苦素含量的相关性分析热图结果显示，其相关规律也分为四类：I类包括ciclev10001521m、ciclev10012453m、ciclev10001658m三个基因，这三个基因在甜橙类品种以及旺苍皱皮柑和盛田温州蜜柑叶片中的表达量与类柠檬苦素含量呈现高度正相关；Ⅱ类模式中的ciclev10031065m、ciclev10000886m、ciclev10003388m在两个甜橙品种中相关规律相似；Ⅲ类模式中的ciclev10021695m和ciclev10027587m在柚类品种中相关规律相似。综合以上结果筛选出4个重点关注的候选基因，分别是MYB(ciclev10021695m)、bHLH(ciclev10012453m)，CYP450(ciclev10031065m， ciclev10000886m)。选择ciclev10021695m进行下一步的深入研究。
(2)生物信息学分析显示ciclev10021695m是一个典型的R2R3MYB转录因子，其氨基酸序列与拟南芥AtMYB42的同源性为55.86%，因此将其命名为CiMYB42。进化关系分析显示CiMYB42与AtMYB42和AtMYB85聚在一起，AtMYB42和AtMYB85参与植物木质素的生物合成。由此可见，CiMYB42可能也参与植物次生代谢生物合成的调控。随后我们通过柑橘的遗传转化对CiMYB42进行功能验证。表型分析发现CiMYB42过表达植株与对照植株形态学上无显著差异，而RNAi植株出现一定程度的矮化和节间缩短的表型，说明干扰CiMYB42对植物的生长发育产生了一定的影响。转基因CiMYB42同时也改变了类柠檬苦素的含量，过表达CiMYB42柠檬苦素总量增加了16.08%，干扰CiMYB42导致柠檬苦素总量减少了22.09%。且过表达CiMYB42导致类柠檬苦素增加主要是柠檬苦素的积累，柠檬苦素含量在过表达CiMYB42植株中增加了近50%，与对照成显著性差异；而干扰CiMYB42导致类柠檬苦素含量减少主要是诺米林含量的降低，诺米林含量在干扰植株中降低了48.76%，与对照成显著性差异，诺米林在过表达植株中仅增加了3.31%。CiMYB42转基因植株中表达分析结果表明CiMYB42过表达株系中该基因的表达量有显著提高，三个株系种的表达量均与对照呈显著差异。尤其是在OE-1和OE-3株系中，CiMYB42基因的表达量是对照的6倍，过表达效果显著。3个干扰株系都不同程度地降低了CiMYB42的表达量，分别降低了39%、67%和72%，与对照相比差异显著。转基因植株中三萜类物质生物合成相关基因的表达分析结果表明，CiOSC的表达与CiMYB42呈正相关关系，CiSQS的表达则与CiMYB42呈负相关关系。
(3)为了进一步验证CiMYB42与CiSQS和CiOSC基因之间的关系，我们用酵母单杂和EMSA来进行验证。CiSQS和CiOSC基因启动子(约2000bp)上的顺式元件分析结果表明CiSQS和CiOSC基因都含有多个MYB、bHLH、WRKY转录因子结合元件，都有可能是这三类转录因子的靶基因；但CiSQS响应多种植物激素的调控，而CiOSC可能更偏向于响应脱落酸的调节；大量串联的光响应元件和根叶特异表达元件表明CiSQS和CiOSC基因启动子可能是一个光诱导型根叶特异表达启动子。随后我们用酵母单杂交验证了CiMYB42与CiSQS和CiOSC基因之间的相互作用。成功构建诱饵载体pAbAi-SQS和pAbAi-OSC以及猎物载体pGADT7-MYB42。诱饵载体pAbAi-SQS在AbA浓度为200ng/mL时，能够抑制报告基因的本底表达；pAbAi-OSC诱饵菌株的最低AbA抑制浓度为500ng/mL.说明这两个诱饵载体能够消除酵母单杂交体系中的自激活，该体系可以用于互作验证试验。酵母单杂交结果证明CiMYB42特异的与CiOSC的启动子结合。为了消除酵母单杂交的假阳性率，EMSA被用于验证CiMYB42蛋白的靶标元件验证。构建了原核表达载体pMAL-C2X-MYB42-His，重组蛋白分子量约为70kDa,并且在大肠杆菌Rosette(DE3)中成功表达。表达条件为诱导温度30℃，IPTG浓度为0.5mM，诱导时间4h。CiMYB42重组蛋白与三个探针的EMSA结合试验表明CiMYB42蛋白与MYBcoretypeⅡ元件(核心序列TTGTTG)有迁移条带。由此可见，CiMYB42通过结合CiOSC启动子上的含有TTGTTG核心序列的MYBcoretypeⅡ元件来调控CiOSC的表达。
(4)为了深入了解转基因CiMYB42对类柠檬苦素代谢及其他次生代谢途径的影响，利用RNA-Seq技术对CiMYB42过表达、干扰和对照植株进行测序分析。9个样本获得的Cleanreads数占总Reads的比率为98.57%-99.83%，Totalmapped到甜橙基因组的Reads占比在88.85%-92.83%，Q20值在98.19%之上，Q30值均达到94.33%以上，说明测序获得的数据可靠。所有样本FPKM值在3.5以上的reads基本趋于饱和，表明该样品的测序量足以代表真实的基因表达水平，测序深度已足够。所有样本的基因覆盖度表现较均一，无明显偏向性。CDS区域的测序序列定位的百分比含量在为75.52%-87.35%之间，可达到建库要求。转基因CiMYB42对不同染色体的reads数目、新转录本、可变剪切以及SNP/Indel数目产生了一定的影响。此外，转基因CiMYB42在p-adjust<0.01&|log2FC|>=1的条件下产生了大量的差异表达基因。获得表达差异的基因共有2123个，过表达与对照组的差异表达基因383个，干扰与对照组的差异表达基因1876个。对这些差异表达基因的表达模式进行K-means聚类分析，结果显示有3个亚组聚在一支，分别含有74,387和364个基因，含有34个差异表达基因的分支与其他两支的表达模式相反，单独聚在一支，而其他6个亚组聚在同一分支。对前四支共825个差异表达基因进行GO功能注释发现，近一半(42.77%)的差异表达基因与代谢相关。KEGG功能注释发现这些参与代谢的差异表达基因除了与萜类代谢和其他次生代谢有关以外，还有大量差异表达基因与三大初生代谢碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢有关，其余则与转录、翻译、信号转导、环境响应等有关。CiMYB42基因表达的改变不仅影响参与萜类代谢相关基因的表达，同时也对其他次生代谢途径及三大初生代谢途径均产生了一定的影响。对以上参与次生代谢的51个差异表达基因进行KEGG功能富集，分析了CiMYB42表达的改变主要影响的次生代谢途径。结果发现转基因CiMYB42不仅影响了三萜、倍半萜、单萜等萜类代谢相关基因的表达，也影响了苯丙氨酸代谢途径相关基因的转录水平。表明CiMYB42可能参与多条代谢途径，不仅能够调节萜类代谢相关基因的表达，也可能调节苯丙氨酸代谢途径相关基因的转录水平，即CiMYB42可能对两条独立的代谢途径有共调节作用。
(1)对九个不同柑橘品种三个不同发育时期叶片的类柠檬苦素的积累规律和21个候选基因的表达模式以及两者之间的关联性进行了分析，结果表明：总体来看，遗传背景的差异是影响类柠檬苦素含量差异的重要因素，不同类别柑橘品种类柠檬苦素的含量差异较大。九个品种的类柠檬苦素含量在0.02-0.53mg/g之间；柚类品种广西沙田柚和早熟暹罗蜜柚类柠檬苦素含量较高，在0.15-0.22mg/g之间，宽皮柑橘类品种盛田温州蜜柑、宫川温州蜜柑、旺苍皱皮柑类柠檬苦素含量较低，在0.04-0.08mg/g之间，而宽皮柑橘与柚类的杂交后代甜橙类含量最高，在0.25-0.53mg/g之间，金柑类含量最低，在0.02-0.05mg/g之间。另外，宽皮柑橘中的3个品种中，旺苍皱皮柑叶片中类柠檬苦素的含量最高，宫川温州蜜柑次之，盛田温州蜜柑最低，这可能与遗传背景有关。综上所述，不同类别柑橘品种叶片中类柠檬苦素的含量高低依次为甜橙类>柚类>宽皮柑橘类>金柑类。此外，在叶片发育过程中不同品种的类柠檬苦素含量变化呈现出了不同规律。21个候选基因的表达模式主要分为四个类群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，I类群只有ciclev10015042m，该基因在甜橙类和金柑类品种中高表达；Ⅱ类群包括ciclev10029650m、ciclev10021695m、ciclev10031065m、ciclev10012453m，这四个基因表达量范围接近，且都在柚类品种中高表达；Ⅲ类群包括ciclev10011386m、ciclev10007937m、ciclev10020010m、ciclev10000886m、ciclev10005233m，该类群中5个基因都在橙类品种中高表达。候选基因表达量与类柠檬苦素含量的相关性分析热图结果显示，其相关规律也分为四类：I类包括ciclev10001521m、ciclev10012453m、ciclev10001658m三个基因，这三个基因在甜橙类品种以及旺苍皱皮柑和盛田温州蜜柑叶片中的表达量与类柠檬苦素含量呈现高度正相关；Ⅱ类模式中的ciclev10031065m、ciclev10000886m、ciclev10003388m在两个甜橙品种中相关规律相似；Ⅲ类模式中的ciclev10021695m和ciclev10027587m在柚类品种中相关规律相似。综合以上结果筛选出4个重点关注的候选基因，分别是MYB(ciclev10021695m)、bHLH(ciclev10012453m)，CYP450(ciclev10031065m， ciclev10000886m)。选择ciclev10021695m进行下一步的深入研究。
(2)生物信息学分析显示ciclev10021695m是一个典型的R2R3MYB转录因子，其氨基酸序列与拟南芥AtMYB42的同源性为55.86%，因此将其命名为CiMYB42。进化关系分析显示CiMYB42与AtMYB42和AtMYB85聚在一起，AtMYB42和AtMYB85参与植物木质素的生物合成。由此可见，CiMYB42可能也参与植物次生代谢生物合成的调控。随后我们通过柑橘的遗传转化对CiMYB42进行功能验证。表型分析发现CiMYB42过表达植株与对照植株形态学上无显著差异，而RNAi植株出现一定程度的矮化和节间缩短的表型，说明干扰CiMYB42对植物的生长发育产生了一定的影响。转基因CiMYB42同时也改变了类柠檬苦素的含量，过表达CiMYB42柠檬苦素总量增加了16.08%，干扰CiMYB42导致柠檬苦素总量减少了22.09%。且过表达CiMYB42导致类柠檬苦素增加主要是柠檬苦素的积累，柠檬苦素含量在过表达CiMYB42植株中增加了近50%，与对照成显著性差异；而干扰CiMYB42导致类柠檬苦素含量减少主要是诺米林含量的降低，诺米林含量在干扰植株中降低了48.76%，与对照成显著性差异，诺米林在过表达植株中仅增加了3.31%。CiMYB42转基因植株中表达分析结果表明CiMYB42过表达株系中该基因的表达量有显著提高，三个株系种的表达量均与对照呈显著差异。尤其是在OE-1和OE-3株系中，CiMYB42基因的表达量是对照的6倍，过表达效果显著。3个干扰株系都不同程度地降低了CiMYB42的表达量，分别降低了39%、67%和72%，与对照相比差异显著。转基因植株中三萜类物质生物合成相关基因的表达分析结果表明，CiOSC的表达与CiMYB42呈正相关关系，CiSQS的表达则与CiMYB42呈负相关关系。
(3)为了进一步验证CiMYB42与CiSQS和CiOSC基因之间的关系，我们用酵母单杂和EMSA来进行验证。CiSQS和CiOSC基因启动子(约2000bp)上的顺式元件分析结果表明CiSQS和CiOSC基因都含有多个MYB、bHLH、WRKY转录因子结合元件，都有可能是这三类转录因子的靶基因；但CiSQS响应多种植物激素的调控，而CiOSC可能更偏向于响应脱落酸的调节；大量串联的光响应元件和根叶特异表达元件表明CiSQS和CiOSC基因启动子可能是一个光诱导型根叶特异表达启动子。随后我们用酵母单杂交验证了CiMYB42与CiSQS和CiOSC基因之间的相互作用。成功构建诱饵载体pAbAi-SQS和pAbAi-OSC以及猎物载体pGADT7-MYB42。诱饵载体pAbAi-SQS在AbA浓度为200ng/mL时，能够抑制报告基因的本底表达；pAbAi-OSC诱饵菌株的最低AbA抑制浓度为500ng/mL.说明这两个诱饵载体能够消除酵母单杂交体系中的自激活，该体系可以用于互作验证试验。酵母单杂交结果证明CiMYB42特异的与CiOSC的启动子结合。为了消除酵母单杂交的假阳性率，EMSA被用于验证CiMYB42蛋白的靶标元件验证。构建了原核表达载体pMAL-C2X-MYB42-His，重组蛋白分子量约为70kDa,并且在大肠杆菌Rosette(DE3)中成功表达。表达条件为诱导温度30℃，IPTG浓度为0.5mM，诱导时间4h。CiMYB42重组蛋白与三个探针的EMSA结合试验表明CiMYB42蛋白与MYBcoretypeⅡ元件(核心序列TTGTTG)有迁移条带。由此可见，CiMYB42通过结合CiOSC启动子上的含有TTGTTG核心序列的MYBcoretypeⅡ元件来调控CiOSC的表达。
(4)为了深入了解转基因CiMYB42对类柠檬苦素代谢及其他次生代谢途径的影响，利用RNA-Seq技术对CiMYB42过表达、干扰和对照植株进行测序分析。9个样本获得的Cleanreads数占总Reads的比率为98.57%-99.83%，Totalmapped到甜橙基因组的Reads占比在88.85%-92.83%，Q20值在98.19%之上，Q30值均达到94.33%以上，说明测序获得的数据可靠。所有样本FPKM值在3.5以上的reads基本趋于饱和，表明该样品的测序量足以代表真实的基因表达水平，测序深度已足够。所有样本的基因覆盖度表现较均一，无明显偏向性。CDS区域的测序序列定位的百分比含量在为75.52%-87.35%之间，可达到建库要求。转基因CiMYB42对不同染色体的reads数目、新转录本、可变剪切以及SNP/Indel数目产生了一定的影响。此外，转基因CiMYB42在p-adjust<0.01&|log2FC|>=1的条件下产生了大量的差异表达基因。获得表达差异的基因共有2123个，过表达与对照组的差异表达基因383个，干扰与对照组的差异表达基因1876个。对这些差异表达基因的表达模式进行K-means聚类分析，结果显示有3个亚组聚在一支，分别含有74,387和364个基因，含有34个差异表达基因的分支与其他两支的表达模式相反，单独聚在一支，而其他6个亚组聚在同一分支。对前四支共825个差异表达基因进行GO功能注释发现，近一半(42.77%)的差异表达基因与代谢相关。KEGG功能注释发现这些参与代谢的差异表达基因除了与萜类代谢和其他次生代谢有关以外，还有大量差异表达基因与三大初生代谢碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢有关，其余则与转录、翻译、信号转导、环境响应等有关。CiMYB42基因表达的改变不仅影响参与萜类代谢相关基因的表达，同时也对其他次生代谢途径及三大初生代谢途径均产生了一定的影响。对以上参与次生代谢的51个差异表达基因进行KEGG功能富集，分析了CiMYB42表达的改变主要影响的次生代谢途径。结果发现转基因CiMYB42不仅影响了三萜、倍半萜、单萜等萜类代谢相关基因的表达，也影响了苯丙氨酸代谢途径相关基因的转录水平。表明CiMYB42可能参与多条代谢途径，不仅能够调节萜类代谢相关基因的表达，也可能调节苯丙氨酸代谢途径相关基因的转录水平，即CiMYB42可能对两条独立的代谢途径有共调节作用。