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烟碱类杀虫剂吡虫啉（imidacloprid,MI）可被嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophila CGMCC 1.1788 以羟基化途径共代谢,在异源表达S.maltophila.CGMCC 1.1788基因的过程中,笔者所在实验室发现大肠杆菌Escherichia coli也可共代谢IMI。本文对E.col/DH10B的IMI代谢途径和代谢机制开展了研究;对其基因组中的13个单加氧酶基因进行了敲除或过表达,分析这些单加氧酶是否具有IMI羟基化功能;对E.coli DH10B和S.maltophila.CGMCC 1.1788的5-hydroxy IMI脱水酶开展了盐析和分子筛纯化。以琥珀酸钠为初级能源物质,E.coli DH10B静息细胞转化6 d后IMI减少1.16mmol/L,代谢率为67%。液相色谱质谱联用（LC/MS）分析表明,IMI代谢过程中产生两个产物5-羟基吡虫啉（5-hydroxy IMI）和烯式吡虫啉（olefin IMI）。5-hydroxy IMI 和 olefin IMI 的生成量分别为 0.23 和 0.17 mmol/L。在E.col/DH10B（genebank登录号:NC010473）中搜索到13个单加氧酶和羟基化酶基因ssuD、rutA、mhpA、ybiX、ygiN、yqeB、yqeC、visC、ycfD、ydhR、ubiB、ubiF和ubiH,其中后3个基因为条件致死型基因。采用Red/ET同源重组技术,以pSC101-BAD-gbaA质粒为介导,以PSNR质粒中的sacB和neo基因置换靶基因。采用Agilent 1200型HPLC仪测定在添加琥珀酸钠条件下,靶基因敲除菌株和野生菌株的IMI羟基化活性的变化。研究结果表明ssuD、rutA、mhpA、ybiX、ygiN、yqeB、yqeC、visC、ycfD、ydhR 这 10 个靶基因敲除菌株与野生E.col/DH10B共代谢IMI没有明显差异。对uibB、ubiH和ubiF进行克隆表达,将连接目的基因的pET28a表达载体导入表达菌株E.coli Rosetta并进行诱导表达,含表达蛋白的菌株和对照组相比,也没有明显的IMI羟基化活性的提高。作者进一步开展了 5-hydroxy IM1脱水酶的分离纯化工作。采用French press压榨法破碎E.coli DH10B细胞,获得的细胞提取液分别采用20%、40%、60%和80%硫酸铵进行分级沉淀,收集各级沉淀蛋白,以5-hydroxy IMI为底物进行转化,HPLC分析显示E.col/DH10B分级沉淀蛋白不能将5-hydroxy IMI转化为olefin IMI。在40%硫酸铵浓度下盐析出的蛋白组分以琥珀酸钠为共代谢底物转化5-hydroxy IMI,产生两个新产物峰,保留时间分别为3.1和5.6 min（olefin IMI的保留时间6.0 min）。LC/MS显示这两个产物的质荷比（m/z）分别是144和272,这两个产物分别是IMI断裂亚甲基桥后的氧化产物及其与琥珀酸缩合产物。20%和40%硫酸铵盐析获得的S.maltophilia CGMCC1.1788蛋白沉淀具有合成olefin IMI的能力。采用分子筛凝胶层析进一步分离蛋白,结果表明20%硫酸铵盐析出的蛋白组份出现7个蛋白洗脱峰。其中第3个蛋白洗脱峰可将5-hydroxy IMI转化为olefinIMI,目前正在进行进一步的分离纯化和蛋白质谱鉴定。