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研究背景和目的骨癌痛是一种较严重的癌痛,通常由原发性骨肉瘤或继发于乳腺癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤转移所致,其疼痛程度与骨组织破坏紧密相关。探寻其生物机理很大程度依赖于动物模型建立。根据Medhurst等报道方法,本实验用MADB-106大鼠乳腺癌细胞复制骨癌痛模型,以期对骨癌痛机制进行研究。伤害刺激和组织炎症能导致外周(增加伤害初级传入神经末梢兴奋性)及中枢(增加后角神经元兴奋性)敏化,大量实验研究证明中枢神经系统中胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)被炎症或外周神经损伤所激活,参与脊髓痛觉传递和中枢敏化。在炎性痛及神经病理痛中星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物OX-42被激活,而且小胶质细胞激活早于星形胶质细胞。然而,有关胶质细胞在骨癌痛中的作用研究很少。p38是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)家族成员之一,与细胞应激有关,已知有四种亚型即α,β,γ和δ。这些亚型分布在外周组织,而p38α与局部炎症级联效应有关。这些亚型在基质选择、活化方式、对抑制剂的反应性等方面各不相同。在哺乳动物中枢神经系统,仅有p38α和p38β表达,p38α和p38β表达在鼠脑神经元,p38β也在胶质细胞表达。实验研究证明外周炎症或神经损伤引起的疼痛以对传入刺激高反应为特征,痛觉高敏发生在脊髓水平对伤害传入易化。伤害传入导致脊髓上肽类物质和兴奋性氨基酸释放,它们通过各自受体、信号通路产生中枢敏化。如p38活化磷脂酶A2产生花生四烯酸,花生四烯酸经环加氧酶途径代谢产生能易化脊髓背角活性的前列腺素。组织及神经损伤或脊髓NK-1受体、NMDA受体直接激活脊髓小胶质细胞内的p38,这提示小胶质细胞内的p38MAPK在脊髓痛觉传递和敏化中起重要作用。有关p38α和p38β在骨癌痛大鼠脊髓中的细胞定位、表达及在痛敏中作用尚不清楚。当今治疗骨癌痛的方法有通过减小肿瘤体积,包括放疗,化疗,和/或手术;用非甾体抗炎药或鸦片类药物减轻炎性相关疼痛等,这些方法常伴有较多副作用。反义寡核苷酸技术由于其寡核苷酸分子能够特异性结合并阻断靶基因mRNA转录、翻译,从而抑制有害目的基因表达,而被引用至慢性疼痛研究领域。本研究旨在将反义寡核苷酸技术引入骨癌痛的实验研究,试图为临床癌痛治疗提供一条新途径。研究方法与结果1、大鼠骨癌痛模型建立方法:选择雌性SD大鼠20只,随机分为对照组和模型组,每组10只。对照组:左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl Hank液;模型组:按照Medhurst等的方法制作胫骨癌痛模型,大鼠麻醉后仰卧位捆绑,从左侧胫骨上部切开皮肤,分离肌肉,暴露胫骨,使用20ml注射器针头穿刺打孔,之后换上10μl注射器进入骨髓腔,缓慢注入3μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞(4.8×103/μl ),注射完毕后用骨蜡封住针孔,皮肤缝合。术前测定两组大鼠术侧后爪机械痛及辐射热痛的缩爪阈值,术后1～22d隔日测定术侧后爪机械痛及辐射热痛的缩爪阈值。术后第8、14、22 d,两组大鼠术侧后肢进行X射线拍片和苏木精-伊红染色,观察骨质破坏情况。结果:(1)疼痛行为学观察:术后1～6d,模型组大鼠术侧后爪的机械痛缩爪阈值较对照组无统计学差异(P >0.05),而辐射热痛的缩爪阈值较对照组显著升高(P<0.05);术后14～22d,模型组大鼠术侧后爪的机械痛和辐射热痛缩爪阈值分别较对照组显著降低(P<0.05)。(2)影像学观察:X射线显示,模型组大鼠在术后第8d仅见注射部位松质骨有小的放射性缺省病灶;术后第14d松质骨放射性病灶增多,单侧骨皮质缺失;术后第22d双侧骨皮质缺失并移位性骨折。而对照组大鼠在术后第8、14、22d术侧后肢未发现骨质破坏。(3)组织学观察:术后第8、14、22d将术侧后肢石蜡切片、苏木精-伊红染色显示,对照组大鼠未见骨小梁、骨皮质破坏。而模型组大鼠在术后第8d可见骨髓腔有异型细胞,骨小梁未见广泛破坏;术后第14d可见肿瘤细胞充填骨髓腔,骨小梁广泛破坏;术后第22d可见肿瘤细胞穿破骨皮质,侵及周围肌肉及软组织。2、骨癌痛大鼠术侧腰段脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞活化的研究方法:选择雌性SD大鼠20只,随机分为对照组和模型组,每组10只。对照组:左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl Hank液;模型组:左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞(4.8×103/μl)。术前测定两组大鼠术侧后爪机械痛及辐射热痛的缩爪阈值,术后1～22d隔日测定术侧后肢机械痛及辐射热痛的缩爪阈值。术后22d测痛后,使用4%多聚甲醛灌注大鼠,取大鼠脊髓L4-6节段,采用免疫组织化学方法观察骨癌痛大鼠腰段脊髓中星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应阳性产物及OX42标记的小胶质细胞阳性产物分布及变化。结果:(1)术后1～6d,模型组大鼠术侧后爪的机械痛缩爪阈值较对照组无统计学差异(P>0.05),而辐射热痛的缩爪阈值较对照组显著升高(P<0.05);术后14～22d,模型组大鼠术侧后爪的机械痛和辐射热痛缩爪阈值分别较对照组显著降低(P<0.05)。(2)免疫组化显示,模型组大鼠术侧腰脊髓背角和腹角可见大量GFAP阳性星形胶质细胞(染色加深,胞体增大,突起变粗变长),最明显在背角I-IV层和X层(中央管周围),而对照组术侧腰段脊髓背角仅见少量GFAP阳性星形胶质细胞。模型组大鼠术侧腰脊髓背角GFAP免疫反应光密度值明显高于对照组(P<0.05)。模型组大鼠术侧腰段脊髓背角可见大量OX42阳性的小胶质细胞(表现为分支减少且肥大),而对照组术侧腰段脊髓背角仅见少量OX42阳性的小胶质细胞。模型组大鼠术侧腰脊髓背角OX42免疫反应光密度值明显高于对照组(P<0.05)。3、骨癌痛大鼠术侧腰段脊髓p38ɑ和p38β的细胞定位及表达方法:选择雌性SD大鼠20只,随机分为对照组和模型组,每组10只。对照组:左侧胫骨上段骨髓腔注3μl Hank液;模型组:左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞(4.8×103/μl)。术前测定两组大鼠术侧后爪机械痛及辐射热痛的缩爪阈值,术后1～14d隔日测定术侧后肢机械痛及辐射热痛的缩爪阈值。术后14d测痛结束,灌注固定取大鼠脊髓L4-6节段,采用免疫组织化学ABC法和荧光双标法观察大鼠术侧腰段脊髓背角p38α和p38β的分布和细胞定位。每组剩余7只大鼠断头处死后分离L4-6左右侧脊髓,提取大鼠脊髓的RNA,以RT-PCR技术检测模型组与对照组大鼠p38α和p38β表达的相对差异。结果:术后第14d,模型组大鼠术侧后爪机械痛和辐射热痛的缩爪阈值较对照组显著降低(P<0.05)。模型组大鼠术侧腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅳp38α和p38β的光密度值明显高于对照组(P<0.05)。荧光双标显示,模型组大鼠术侧腰段脊髓背角p38α与神经元特异性核蛋白标志物NeuN有共表达,p38β与小胶质细胞标志物OX-42有共表达。模型组大鼠手术侧p38α、p38β的mRNA表达较非手术侧显著升高(P<0.05),与对照组手术侧比较也明显升高(P<0.05)。4、鞘内注射p38βMAPK反义寡核苷酸对骨癌痛大鼠痛觉过敏的影响方法:选择雌性SD大鼠40只,随机分为四组,每组10只。A组(对照组):大鼠左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl Hank液;B组(模型组):大鼠左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞(4.8×103/μl);C组(p38β-SODN 20ug处理组)和D组(p38β-ASODN 20ug处理组)大鼠左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞(4.8×103/μl),14d后鞘内分别注射p38β-SODN 20ug及p38β-ASODN 20ug,1次/d,连续6d ,而A、B组以同样的方法鞘内注射等量无菌生理盐水作对照。术前测定四组大鼠术侧后爪机械痛及辐射热痛的缩爪阈值,术后1～22d隔日测定术侧后肢机械痛及辐射热痛的缩爪阈值。术后第22d,取大鼠脊髓L4-6节段,采用Western blot法检测脊髓p38β蛋白的表达。结果:术后14～22d p38β-ASODN 20ug组大鼠术侧后爪机械痛和辐射热痛的缩爪阈值较模型组和p38β-SODN 20ug组显著升高(P<0.05),而与对照组比较差异无统计学意义(P >0.05)。Western Blot结果显示,p38β-ASODN 20ug组p38β蛋白质相对表达量较模型组和p38β-SODN 20ug组显著降低(P<0.05),而与对照组比较,差异无统计学意义(P >0.05)。5、统计学方法应用SPSS11.0软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。测痛数据采用重复测量数据的方差分析,其余数据采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结论1.采用MADB-106大鼠乳腺癌细胞系能成功复制大鼠胫骨癌痛模型。2.骨癌痛大鼠术侧腰段脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞均被广泛激活。3.脊髓p38α和p38β参与了骨癌痛的发生和发展,p38α主要在脊髓神经元表达,而p38β则在脊髓小胶质细胞中表达。4.鞘内注射p38β反义寡核苷酸能减轻骨癌痛大鼠机械性痛觉超敏及辐射热痛觉过敏,这种作用可能是通过下调脊髓p38β蛋白质的表达来发挥的。