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番茄(Solanum lycopersicum)属茄科番茄属,是重要的种植蔬菜之一,因其风味独特,营养丰富,可选择类型多,既可鲜食也可再加工,受到人们广泛欢迎。番茄植株对于环境适应性较强,加上近些年棚室技术的推广和应用,番茄种植面积不断扩大,具有很高的商业价值,2016年年产量达1.77亿吨,经济价值达600亿美元。因其对环境适应性较强,生长周期较短,是严格的自花授粉植物而且基因组较小,成为了基因组研究及研究植物遗传进化的模式植物之一,2012年番茄基因组完成测序,为番茄基因组及基因功能研究提供了有利条件。番茄叶霉病是番茄保护地栽培中常见的一种病害,感染番茄叶霉病会严重影响番茄的品质和产量。番茄Cf基因产物可以与番茄叶霉病病原菌的Avr基因产物特异性识别,使携带Cf基因的番茄植株具有抗病性,携带Cf-4、Cf-5或者Cf-9基因的番茄品种可以体现良好的田间抗性,但随着番茄叶霉病生理小种的不断分化,已经利用的基因不断被克服,因此抗原匮乏的问题日益严峻。携带番茄Cf-19基因的番茄品种在多年的番茄种植实践中表现出良好的抗病性,与其他Cf基因相比,Cf-19基因具有更强的免疫效果和更广的抗性范围,前期的研究中我们对该基因进行了克隆,明确了该基因的序列及结构信息,但是对于其抗病应答机制还不清楚。为进一步明确该基因的抗病应答机制,我们通过对含有Cf-19基因的抗病品种(CGN18423)和感病品种(Moneymaker)接种番茄叶霉病生理小种1.2.3.4,并采集接种后的0、7和20天的番茄叶片,测定其叶片内水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)含量,并运用RNA-seq测序技术,对转录组数据进行分析,筛选重要调控通路和抗病相关基因,同时采用VIGS基因沉默技术对筛选出的重要抗病相关基因进行初步功能验证,明确其在番茄Cf-19基因介导的抗病应答中的作用。通过实验得到以下结论:(1)激素含量测定结果表明:CGN18423植株和Moneymaker植株SA含量均在第7天时达到最大值,第20天时达到最低值且低于接种前,在0-20天的过程中都呈现先上升后下降的趋势。CGN18423植株JA含量在第7天时达到最大值,第20天时含量下降与接种前水平相近。整体呈现先上升后下降趋势。Moneymaker植株JA含量在0-20天的过程中略有上升。(2)本实验共检测了18个样品,每个样品平均产出4.40 Gb数据。预测的新基因为1,513个;共检测到表达的基因数为25,779个,其中已知的基因为24,295个,预测的新基因为1,484个;转录重组后,共获得20,395个新转录本,其中8,521个为已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型,1,513个属于新的蛋白编码基因的转录本,还有10,361个属于长链非编码RNA。(3)在CGN18423植株应答过程中,共鉴定出418个差异表达基因,通过GO分析差异基因主要被注释在“质膜”、“组氨酸脱羧酶活性”、“羧酸代谢过程”等GO分类上。KEGG分析显示,0-7天这一过程中,与Moneymaker植株相比“植物激素信号转导”是CGN18423植株特有的差异代谢通路。(4)通过对植物与病原菌互作通路和植物激素信号通路进行分析,共获得了包括“色氨酸代谢”途径中的“SAUR”,“玉米素生物合成”途径中的“A-ARR”,“油菜素类固醇生物合成”途径中的“BRI1”,“α-亚麻酸代谢”途径中的“JAZ”,以及“Ca MCML”、“WRKY25/22”、“WRKY28/33”、“CERK1”、“RRS1-R”和“WRKY1/2”在内的10个关键调控点,并挖掘了各调控点的重要差异基因。(5)根据本研究结果和已有知识体系,建立了Cf-19基因介导的抗病应答预测模型。当携带Cf-19基因的植株感染叶霉病时,同时触发ETI和PTI。随后,Ca2+与不同的CAM/CML蛋白结合,进入下游信号通路。细胞内Ca2+浓度的增加也为CDPK、MAPK信号成分的激活创造了条件。许多TFs,特别是WRKYs,大量积累并间接调节了防御相关基因的表达。这些变化最终导致了防御应答和HR现象产生。在整个抗性反应过程中,SA和JA都发挥着重要的调节作用,JAZ很可能是维持这两种激素平衡的关键因素。另外,CKs、BRs、生长素和ET可能通过改变细胞形态或影响激素调节网络中的其他功能在抗性反应中发挥重要作用。(6)采取VIGS技术对重要差异应答基因SAMDC进行了功能研究,结果发现抗病材料中沉默该基因,植株叶片中PA含量下降,接种后叶片边缘的部分过敏性坏死斑内有菌丝发生限制性生长,说明植株的抗病能力有所降低。