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背景：骨肉瘤(OS)是骨科中最为常见的原发恶性骨肿瘤,多发生于15-25岁的儿童和青少年,好发部位为四肢长管状骨的干骺端,其中发生在股骨远端和胫骨近端约占总病例数的50%。由于骨肉瘤的局部破坏性强,致残率及死亡率高,且极易发生远处转移,多累及肺部,因此受到研究者的广泛重视。随着新技术的快速发展,加上骨肉瘤的手术及抗骨肉瘤药物的联合使用,使原发部位的OS患者的5年存活率已经达到约70%。然而尽管通过各种积极的治疗方式,对转移或复发患者的长期生存机会仍低于20%。这一情况在过去的30年内变化仍然不大。因此,通过研究骨肉瘤的组织异质性、耐药性以及转移的的基本分子机制,为骨肉瘤患者寻找新型标志物进行准确的诊断、治疗和预后的评判显得尤为必要。微小RNA是一类小分子内源性单链非编码RNA分子,它通过与信使RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’UTR)结合,在转录后水平调控靶基因的表达,主要抑制靶基因的翻译或目的mRNA的降解。目前越来越多的证据表明,miRNA在许多疾病的生理和病理生理过程中发挥重要的作用,特别是肿瘤的生长、增殖、分化、凋亡、转移和侵袭。由于miRNA本身的多样性导致其既可以作为肿瘤的抑制因子也可以作为肿瘤的启动子。目前研究发现特定miRNA的异常表达与多种癌症的生长和临床预后有关,但miRNA的失调及其在肿瘤发生中的作用仍然是未知。关于骨肉瘤,虽然也有一些研究表明miRNA与骨肉瘤有关,如miR-34a, miR-183和miR-132,但对这些miRNA在骨肉瘤中的作用我们仍然缺乏了解。根据最新研究我们发现miR-135b在许多人类肿瘤如：结肠癌、乳腺癌和肺癌中表达上调并可能是一种肿瘤促进因子。Wu等人在大肠癌及其淋巴结和远处转移组织中发现mir-135b表达上调,而mir-135b抑制剂可以有效的减少该类肿瘤细胞的转移和侵袭。此外在头颈部鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌及淋巴瘤中都发现miR-135b有促进肿瘤进展作用。最近研究也显示在神经外胚层的发育过程中mir-135b被激活,人类胚胎干细胞中niR-135b的异常表达可通过抑制TGF-β和BMP信号通路促进hESC向神经外胚层转化。mri-135b还参与了受损成骨的分化,通过作用人骨髓间充质干细胞而达到对成骨作用的负调控。以上这些研究都提示mir-135b在人类的生理和病理生理过程中都起到了重要的作用。但是miR-135b是否在骨肉瘤中的作用及其作用机制仍不清楚。而FOXO1是FOXO转录因子家族中的一员,其特点是具有保守的含有DNA结合域的叉头状结构。现有的研究表明FOXO1在多种生物学过程包括细胞增殖,凋亡,分化,DNA损伤修复和应激反应中起着关键作用。例如FOXO1可以通过下调细胞周期调节蛋白D1和上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27和p21蛋白从而导致细胞周期停滞。越来越多的研究发现FOXO1与多种癌症有关。miR-107负调控FOXO1的表达与人胃癌细胞的增殖有关。已经证实核内和转录水平的FOXO1在前列腺癌中均下降,因此可以得出FOXO1的过表达可显著诱导细胞凋亡的结论。在肺癌的细胞和体内模型中FOXO1可抑制EGFR信号的激活,姜黄素可通过诱导FOXO1的表达而抑制肺癌的进展和转移。此外,FOXO1可抑制骨肉瘤细胞的增殖。本研究以miR-135b为主要研究目标,研究其在骨肉瘤中的作用机制并证实FOXO1为其作用靶点,并通过影响FOXO1来达到对骨肉瘤的发生发展进行调节作用。目的：研究人体骨肉瘤组织中miR-135b及FOXO1的表达情况及其之间是否存在相关性,探讨niR-135b在骨肉瘤进展过程中的作用；在骨肉瘤细胞系Saos-2和U2OS中验证niR-135b是否直接调控FOXO1的表达,研究miR-135b在骨肉瘤细胞中对FOXO1的表达调控及其相互间的作用关系。为临床上对骨肉瘤的治疗、诊断及预后的判断提供治疗的靶点,并为今后进一步的使用提供一定的实验基础。方法：第一部分：收集共7例骨肉瘤患者(武汉大学人民医院)的骨肿瘤组织及肿瘤周围正常骨组织,将组织收集后立即将组织置入液氮罐中,通过RT-PCR及Western-blot实验检测骨肉瘤组织及周围正常骨组织中的niR-135b的蛋白表达水平。通过公共数据库来查找miR-135b的靶点,并选择FOXO1作为可能靶点,通过RT-PCR及Western-blot实验检测骨肉瘤组织及周围正常骨组织中的FOXO1的蛋白表达水平,并研究对比其是否存在相关性。第二部分：在骨肉瘤细胞系Saos-2和U2OS的细胞中转染miR-135b抑制剂后,通过RT-PCR及Western-blot实验检测其中miR-135b和FOXO1的蛋白含量,评价miR-135b抑制剂对miR-135b及FOXO1表达的影响。通过在骨肉瘤细胞系Saos-2和U2OS的细胞中分别转染FOXO1野生型基因载体和FOXO1突变型基因载体,与pMir荧光素酶报告基因载体、Prl-TK Renilla双荧光素酶载体、miR-135b抑制剂共同转染后,采用荧光素酶报告基因实验检测miR-135b抑制剂对分别转染FOXO1野生型基因载体和FOXO1突变型基因载体中FOXO1蛋白的表达水平,同时与未转染miR-135b抑制剂中的骨肉瘤细胞中的FOXO1蛋白的表达水平相对比。第三部分：主要研究miR-135b是否对骨肉瘤细胞的生物学特性产生影响,并是否通过影响其靶点FOXO1的表达来达到对骨肉瘤细胞增值和侵袭能力的影响。1)将miR-135b抑制物及对照物转染骨肉瘤细胞后,利用MTS检测mR-135b对骨肉瘤细胞增殖的影响,利用Trans well实验检测niR-135b对骨肉瘤细胞侵袭的影响。2)为了验证miR-135b是否通过FOXO1对骨肉瘤细胞增殖及侵袭产生影响,我们首先通过MTS及Transwell实验验证FOXO1在骨肉瘤中的作用,其次再通过转染特异性调控FOXO1的质粒siRNA及miR-135b抑制物或对照物在骨肉瘤细胞系U20S及Saos-2中后通过MTS及Transwell实验检测其对骨肉瘤细胞在增值及侵袭方面的影响。结果：第一部分：miRNA-135b在人骨肉瘤组织中表达明显上调,并与FOXO1的表达呈负相关：我们分别检测了7例人骨肉瘤组织及其邻近的非肿瘤骨组织中miR-135b的表达情况。我们发现骨肉瘤组织中的miR-135b表达明显高于临近非肿瘤正常骨组织。通过公共数据库(http://www.targetscan.org)来查找miR-135b可能的靶点,并最终选择了具有高度保守结合位点的FOXO1来检测其表达情况和与miR-135b相关性。我们通过检测FOXO1在上述组织中的表达情况,发现FOXO1的mRNA和蛋白在骨肉瘤组织中的表达量比相应的非肿瘤正常骨组织更低。而且miR-135b的表达水平与FOXO1的mRNA和蛋白的表达水平呈负相关。其结果存在统计学意义。第二部分：miR-135b直接调控FOXO1:我们将miR-135b抑制剂及已被证实的miR-135b表达产物转染OS细胞系Saos-2和U20S。结果显示加入miR-135b抑制剂转染的骨肉瘤细胞系Saos-2和U20S细胞中FOXO1的mRNA和蛋白表达水平明显增高。分别构建了含FOXO13’端非翻译区公认的miR-135b下游结合位点的荧光素酶报告基因载体(pMir-FOXO1-Wt,设定为野生型)和敲除了种子区8个碱基对的突变型载体(pMir-FOXO1-Mut,设定为突变型),在转染了niR-135b抑制剂的骨肉瘤细胞系Saos-2和U20S中发现野生型载体的荧光素酶活性被显著的增强,而突变型载体的荧光素酶活性与未转染miR-135b抑制剂的骨肉瘤细胞系Saos-2和U20S中荧光素酶活性相比无明显变化,其结果存在统计学差异。上述实验结果证明了miR-135b是通过与FOXO13’端非翻译区公认的结合位点直接结合来达到对FOXO1表达的负调控作用。第三部分：miR-135b通过调控FOXO1的表达来达到对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响：首先通过转染pLEX-FOXO1可以特异性增强FOXO1的表达,验证FOXO1是否对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力的影响,发现FOXO1可以显著的抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力；其次选择最有特异性调低FOXO1表达的siRNA质粒,通过转染siRNA质粒及miR-135b抑制物或对照物到骨肉瘤细胞后,检测其对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响,结果发现当调低FOXO1的表达后,miR-135抑制剂对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的抑制作用被抵消。结论：我们通过实验证明了miR-135b在骨肉瘤患者的癌旁正常组织和骨肉瘤组织中均存在着表达,并发现在骨肉瘤组织中miR-135b的表达水平与周围非肿瘤正常组织相比有着明显升高。我们通过生物信息学分析和上述实验证实,在骨肉瘤细胞中FOXO1是miR-135b的直接作用靶点,同时在骨肉瘤细胞中miR-135b表达的水平与FOXO1的表达水平存在着负相关性。因此我们发现miR-135b通过对FOXO1靶点的直接作用可以促进及增强骨肉瘤细胞对局部正常组织的增殖和侵袭,这实验表明了miR-135b通过对FOXO1的调节参与到了骨肉瘤的发生发展过程中。从而对骨肉瘤的发生及发展过程起到了推动作用。