石斛属是兰科中的第二大属,我国有76种,有近40种可作药用,枫斗是采用植株形体较矮小、茎肉质粗壮、质地柔软又富含黏液成分的石斛茎加工而成,市场上的枫斗已达20余种。石斛药用始载于《神农本草经》,为我国传统名贵中药,具有益胃生津,滋阴清热的功效,主治热病伤津,胃痛干呕,肺燥干咳,腰膝软弱等症。现代药理实验证明,石斛具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降低血糖等多种活性。名贵石斛需求量日益增加,已成为在国内外享有盛名的天然绿色产品。铁皮石斛为传统石斛佳品,在历代本草均有记载,2010版药典首次将铁皮石斛单列出来。齿瓣石斛为近年开发应用的药用石斛佳品,具有质重、富光泽、黏性强等优良的品质,被人们视为替代铁皮石斛的药材珍品,销往国内外,由齿瓣石斛加工成的紫皮枫斗、紫皮芽的产量远远超过铁皮枫斗,已成为品质佳的石斛枫斗主流产品。兜唇石斛常加工成水草枫斗的一种,是“枫斗类石斛”的重要成员之一。由于水草枫斗与铁皮枫斗、紫皮枫斗等珍贵品种都呈现相同的螺旋状外形,但却有不同的质量、效果和价格。由于不同石斛品种繁多、外形相似、品质各异、价格差异极大,而且大多具有类似的多种复杂成分,现行石斛质量标准难以有效地控制不同石斛的质量,石斛枫斗概念混淆、品种混乱、以假乱真、以次充好的现象仍相当严重,其中名贵的铁皮石斛(铁皮枫斗)、齿瓣石斛(紫皮枫斗)质量问题尤为突出,如紫皮枫斗常冒充铁皮枫斗、紫皮枫斗中常掺假兜唇石斛等。因此,建立可靠、完善的质量控制标准对枫斗类石斛药材的质量有极为重要的意义。中药指纹图谱技术是国内外公认最有效的中药质控方法。本研究选择铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛为研究对象,采用中药指纹图谱技术,进行三种石斛的高效液相色谱(HPLC)特征图谱比较研究,为其质量控制水平的提高提供方法依据,以期对铁皮石斛、齿瓣石斛作出真伪、优劣、掺假的判断,有效地控制其质量。目的:1、建立鲜铁皮石斛的HPLC特征图谱分析方法,为鲜铁皮石斛质量控制提供方法依据;比较同批次鲜铁皮石斛茎与叶的特征图谱相关性,为铁皮石斛叶的开发应用提供参考;探讨同一种质资源不同生长期鲜铁皮石斛的HPLC特征图谱的规律性;初步研究鲜铁皮石斛茎与组培苗之间的关联性,探讨通过分析组培苗特征图谱在优选铁皮石斛种质资源的可行性。2、建立铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛的HPLC特征图谱分析方法,为三种石斛的质量控制及鉴别提供方法依据。3、建立铁皮石斛氨基酸柱前衍生HPLC特征图谱分析方法,比较分析铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛氨基酸特征图谱的共性和差异,为建立三种石斛质量控制方法提供一定参考。方法:1、采用中药HPLC特征图谱技术,建立鲜铁皮石斛HPLC特征图谱分析方法,分析10批样品,采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)进行相似度分析,生成特征图谱共有模式;采用所建立的方法分析比较同批次鲜铁皮石斛茎与叶样品、同一种质资源不同生长期鲜铁皮石斛样品、鲜铁皮石斛茎与组培苗样品的特征图谱相关性。2、建立铁皮石斛(铁皮枫斗)、齿瓣石斛(紫皮枫斗)、兜唇石斛(水草枫斗的一种)HPLC特征图谱分析方法,各分析10批样品,分别生成三种石斛特征图谱共有模式,比较三种石斛特征图谱的共性及差异,并进行相似度评价。3、采用氨基酸柱前衍生方法,结合HPLC特征图谱技术,建立铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛氨基酸HPLC特征图谱分析方法,各分析10批样品,采用相似度软件,分别生成三种石斛氨基酸特征图谱共有模式,探讨三种石斛氨基酸组成和比例的差异,并进行相似度评价。成果:1、建立的鲜铁皮石斛HPLC特征图谱分析方法具有可行性和实用性。(1)鲜铁皮石斛共标示出35个特征共有峰,主要特征峰的紫外光谱可分为四类,其中峰17～峰27为铁皮石斛较专属的特征峰,以共有模式为对照,10批样品相似度为 0.900～0.956。(2)分析了 4批鲜铁皮石斛茎与叶,茎、叶分别标示出33～35、17个特征峰,4批茎的相似度为0.914～0.964,叶的相似度为0.916～0.988,同批次茎与叶之间的相似度为0.802-0.921,提示茎、叶特征成分有一定关联性。(3)同一种质资源不同生长期(6、9、12月)鲜铁皮石斛样品具有较为相似的特征图谱,相似度为0.941～0.971。(4)铁皮石斛组培苗基本含鲜铁皮石斛茎类似的特征峰,同一种质资源的茎与组培苗的特征图谱较为相似。2、建立了可鉴别铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛的HPLC特征图谱分析方法。(1)铁皮石斛共标示出36个特征峰,10批样品相似度为0.898～0.969;齿瓣石斛共标示出27个特征峰,10批样品相似度为0.880-0.977;兜唇石斛共标示出42个特征峰,10批相似度为0.901～0.961。(2)以铁皮石斛共有模式为对照,10批齿瓣石斛、兜唇石斛的相似度分别为0.654～0.784、0.159～0.261,以齿瓣石斛共有模式为对照,10批铁皮石斛、兜唇石斛的相似度分别为0.364～0.495、0.096-0.242;结果表明铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛HPLC特征图谱之间的相似度很低,差异大。(3)结合三种石斛在各保留时间段的特征峰紫外光谱分析,铁皮石斛与齿瓣石斛特征图谱最大的区别是在保留时间60～90min内,铁皮石斛的特征峰个数、峰位、峰形与峰值比例与齿瓣石斛不同,齿瓣石斛基本呈一组典型的黄酮类特征峰,而铁皮石斛具有峰面积虽不大但专属性较强的一组特征峰。兜唇石斛特征图谱最大的区别是在保留时间25～35 min内,呈现峰值比例明显较大的3～4个吸收峰群,由此便可鉴别铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛及掺假兜唇石斛的齿瓣石斛。3、建立了铁皮石斛氨基酸柱前衍生HPLC特征图谱分析方法,比较了铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛氨基酸组成的共性及差异性。(1)铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛分别标示出20、21、20个氨基酸特征峰,其中鉴别出15～16个对人体有益的18种氨基酸成分(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、络氨酸,峰1～峰18);未鉴别的特征峰为峰a～峰e;10批铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛样品相似度分别为0.920～0.999、0.866～0.992、0.927～0.998,同种石斛氨基酸的相似度相对较高。(2)以铁皮石斛氨基酸共有模式为对照,10批齿瓣石斛、兜唇石斛相似度分别为0.693～0.950、0.434～0.713;以齿瓣石斛氨基酸共有模式为对照,10批铁皮石斛、兜唇石斛的相似度分别为0.758～0.848、0.773-0.948,说明铁皮石斛、齿瓣石斛兜唇石斛氨基酸特征图谱之间的相似度有一定的差异。(3)虽然三种石斛部分样品相似度较高,特征峰大体类似,但特征峰峰形、峰值比例不同。铁皮石斛氨基酸绝大部分特征峰的峰面积远大于齿瓣石斛和兜唇石斛,说明铁皮石斛氨基酸含量大于齿瓣石斛与兜唇石斛;除衍生试剂峰外,铁皮石斛最强峰为峰a,其次为峰9(缬氨酸)和峰1(天冬氨酸);齿瓣石斛最强峰a,其次为峰5(精氨酸)和峰b;兜唇石斛的最强峰为峰5(精氨酸),其次为峰1(天冬氨酸)和峰b。结论:1、鲜铁皮石斛HPLC特征图谱分析方法准确可靠,重复性好,为铁皮石斛质量控制提供了方法依据;铁皮石斛茎、叶特征图谱具有关联性,叶中黄酮类成分的峰面积较大,为开发应用铁皮石斛叶作为药用部位提供参考依据;不同生长期铁皮石斛具有较为相似的特征图谱,提示铁皮石斛具有较明显的遗传特性;铁皮石斛组培苗基本具有铁皮石斛茎类似的特征峰,初步验证了组培苗在优选铁皮石斛种质资源的应用可行性。2、铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛HPLC特征图谱有较大差异性,通过相似度评价及特征峰紫外光谱、特征峰的峰数、峰形、峰值比例可鉴别铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石及掺假兜唇石斛的齿瓣石斛;为铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛的质量控制提供方法依据,亦为其他石斛的质量研究提供参考。3、铁皮石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛氨基酸柱前衍生HPLC特征图谱具有一定的共性和差异,可通过氨基酸特征峰的个数、峰值比例及相似度评价,为建立三种石斛质量控制方法提供参考。