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研究背景与目的PA-824(Pretomanid)是一种重要的双环硝基咪唑类药物,在体内外均对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)表现出明显的杀菌活性。PA-824活化过程中,MTB的脱氮黄素依赖性硝基还原酶(deazaflavin-dependent nitroreductase,Ddn)将底物PA-824还原为强效杀菌产物。然而,PA-824对非结核分枝杆菌(Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)临床株的抑菌活性以及分枝杆菌Ddn活化PA-824的关键位点尚不清楚。本研究的目的是通过PA-824对MTB和NTM的体外抑菌实验及多种分枝杆菌Ddn同源蛋白质序列比对、Ddn突变位点分析,探索并验证Ddn中活化PA-824的关键位点,为阐明分枝杆菌对PA-824的耐药机制及开发适宜的耐药诊断技术提供重要科学依据。研究方法(1)利用抗菌药敏试验评估PA-824对MTB和NTM临床菌株的体外抑菌活性,分析不同菌株间的药敏结果。(2)对MTB的Ddn序列与NTM的Ddn同源蛋白质序列进行多重序列比对,并以这些序列为基础构建发育进化树、分析Ddn突变位点。(3)以耻垢分枝杆菌为菌模,构建Ddn突变体质粒,利用电转法在耻垢分枝杆菌中表达Ddn突变蛋白。(4)检测外源表达Ddn突变蛋白对耻垢分枝杆菌生长的影响,利用抗菌药敏试验评估PA-824对表达Ddn突变蛋白的耻垢分枝杆菌的体外抑菌活性。结果(1)PA-824抑制90%的MTB和堪萨斯分枝杆菌生长的最低抑菌浓度(MIC90s)分别为0.12 mg/L和8 mg/L,而对鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌的最低抑菌浓度>32 mg/L。(2)MTB的Ddn与堪萨斯分枝杆菌的Ddn同源蛋白的氨基酸序列具有89.3%同源性,与鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的Ddn同源物的同源性分别为66.6%和63.8%,与偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的Ddn同源物的氨基酸序列同源性较低,同时,系统发育进化树显示结核分枝杆菌的Ddn与堪萨斯分枝杆菌的Ddn同源序列更密切。(3)表达MTB的Ddn的耻垢分枝杆菌对PA-824的敏感性明显升高,MIC从384 mg/L下降24 mg/L,表达Ddn突变蛋白Y65L、A76V或Y133F的耻垢分枝杆菌对PA-824出现高水平的抗性,而表达Ddn突变体V75L、Q125K或V148I的耻垢分枝杆菌与表达MTB野生型Ddn的耻垢分枝杆菌对PA-824的抗性没有明显差异。结论(1)PA-824对不同分枝杆菌的体外抑菌效果差异显著,其中分别对MTB和堪萨斯分枝杆菌具有高效和中等的抑菌效果。(2)Ddn的Y65、A76或Y133是活化PA-824的重要活性位点,其突变是导致不同分枝杆菌对PA-824敏感性差异的主要机制,可以作为结核分枝杆菌对PA-824耐药性诊断的重要分子标志物。