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邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是污染最严重、机体内暴露水平最高的环境内分泌干扰物(EDCs)之一,人群普遍易暴露。DBP通过小肠代谢为邻苯二甲酸单丁酯(MBP),产生干扰效应。近来主要研究的是DBP/MBP对雄性生殖系统的影响。胚胎期暴露于DBP可引起生殖细胞数量下降、隐睾、尿道下裂等类似于睾丸异常发育综合征的表现。人群流行病学研究也发现,DBP/MBP与人类精子浓度下降和精子总数减少密切相关。因此,DBP可能是引起雄/男性生殖系统发育障碍的重要原因之一。凋亡生殖细胞异常增多和多核生殖细胞(MNGs)的出现反映了胎鼠睾丸支持细胞的结构和功能受损及吞噬凋亡生殖细胞能力下降,而支持细胞结构和功能完好性是成年后精子数量和生育力的保证。本研究在动物模型上探讨DBP宫内暴露可导致胎鼠睾丸凋亡生殖细胞和/或MNGs增加。以小鼠睾丸支持细胞(TM4)为模型探讨RhoG-ELMO1-RAC1信号通路在MBP抑制支持细胞吞噬功能中的作用。目的1.探讨DBP对睾丸生殖细胞凋亡和MNGs的影响。2.探讨RhoG-ELMO1-RAC1信号在MBP抑制支持细胞吞噬功能中的作用。方法1.孕鼠动物模型:成年雄性、雌性SD大鼠1:1交配,检查阴栓后孕鼠按体重随机分成3组(20只/组)。在孕12天(GD12)到GD18分别以溶剂对照组、300、500 mg/kg/day剂量的DBP处理7天。GD19天麻醉处死,取胎鼠睾丸置于波恩氏液固定,并分批保存。用于HE染色和TUNEL凋亡染色观察。2.睾丸支持细胞(TM4)作为体外细胞模型,CCK-8法测定MBP对TM4细胞活性影响。3.流式细胞分析仪和免疫荧光化学分析支持细胞微球吞噬能力。4.ORO法观察TM4细胞脂滴分布。5.qRT-PCR测定吞噬相关基因mRNA表达水平。6.Western Blot 测定 RhoG、ELMO 1 和 RAC1 蛋白表达。7.GTP-RAC1试剂盒检测RAC1活性。8.免疫荧光细胞化学法观察TM4细胞内RAC1聚集变化。9.应用质粒转染技术上调RhoG和ELMO1的表达,再用MBP(100 μM)处理TM4细胞,观察TM4细胞GTP-RAC1活性的改变。结果1.DBP促进胎鼠睾丸生殖细胞凋亡孕鼠300、500mg/kg/day DBP暴露后,TUNEL凋亡染色胎鼠睾丸,可见生精小管中生殖细胞凋亡相比对照组明显增加。2.DBP促进胎鼠睾丸MNGs形成孕鼠300、500mg/kg/day DBP暴露后,HE染色胎鼠睾丸,发现生精小管中生殖细胞出现多核现象,MNGs数量增加,支持细胞结构空泡化。3.DBP导致胎鼠生殖细胞数量下降孕鼠300、500 mg/kg/day DBP暴露后,与对照组相比,可见生殖细胞数量明显减少(P<0.05)。4.DBP下调胎鼠睾丸组织ELMO1蛋白表达水平孕鼠300、500 mg/kg/day DBP暴露后,胎鼠睾丸组织ELMO1蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05)。5.MBP抑制TM4细胞吞噬能力CCK-8 实验结果显示,0、1、10、50、100、300、500 μM 不同剂量 MBP处理TM4细胞24h/48h后,TM4细胞的活性均没有明显差异变化。然后,选取4个浓度梯度且不影响细胞活性的MBP剂量(1、1、10、100 μM)处理TM4细胞进行吞噬能力检测。流式细胞仪分析结果显示,MBP抑制TM4细胞吞噬荧光微球能力。油红O实验结果显示100 μM MBP处理组脂滴形成显著减少。6.MBP对RAC1活性、基因表达及其细胞膜聚集的影响qRT-PCR和Western Blot实验结果显示,MBP处理组RAC1mRNA水平和总蛋白未见明显变化。GST pull-down实验结果显示,GTP-RAC1表达量在10和100 μM MBP剂量有明显的下调(P<0.05)。免疫荧光细胞化学染色联合激光共聚焦法结果显示,MBP处理后集中在细胞膜上荧光强度明显减弱,表明MBP对支持细胞RAC1向细胞膜聚集具有抑制作用。7.ELMO1在MBP抑制GTP-RAC1活性中的作用qRT-PCR和Western Blot实验结果发现,MBP可下调ELMO1 mRNA和蛋白表达水平。采用质粒转染过表达ELMO1后,TM4细胞ELMO1和GTP-RAC1表达明显增加,再用MBP(100 μM)处理TM4细胞,RAC1活性蛋白表达水平回复(P<0.05)。8.MBP通过RhoG-ELMO1-RAC1抑制支持细胞吞噬能力qRT-PCR和Western Blot实验结果表明,MBP可下调RhoG mRNA和蛋白表达水平。采用质粒转染过表达RhoG后,TM4细胞ELMO1和GTP-RAC1表达明显增加,再用MBP(100μM)处理TM4细胞,ELMO1和RAC1活性蛋白表达水平回复(P<0.05)。结论DBP引起凋亡生殖细胞和MNGs增多可能与RhoG-ELMO1-GTP-RAC1信号通路有关。