茶树多胺氧化酶基因家族(CsPAOs)的结构分析与功能研究

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本文对茶树多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)基因进行全基因组筛选与结构分析,对部分基因进行克隆与功能验证,通过ABA(abscisic acid,脱落酸)胁迫和厌氧胁迫下CsPAOs基因表达量的测定,结合使用UPLC-MS/MS建立起的茶树组织中多胺检测方法,对逆境胁迫处理后的茶树组织中的多胺含量进行检测,配合氨基酸动态变化,对多胺在茶树逆境胁迫下的作用进行了研究,结果如下:1.建立在茶树组织中利用UPLC-MS/MS检测多胺的方法,对茶树单芽、一叶、花,根不同部位中的多胺含量进行测定。其中Put(putrescine,腐胺)在根中含量最高,达到0.31μg/g;Spd(spermidine,亚精胺)含量在不同组织中差别较大,在1.21μg/g-13.45μg/g之间,其中单芽含量最高,一叶最低。2.利用茶树基因组数据库筛选到七条CsPAOs基因,分别命名为CsPAO1-7。进行系统进化树分析与基因结构分析,并利用qPCR对七条CsPAOs基因在不同组织中表达活性进行检测,3.选择其中三条CsPAO基因(CsPAO1,CsPAO4,CsPAO5)进行体外酶活验证,构建表达载体并成功进行异源表达,获得可溶性蛋白,酶活检测结果表明3个基因工程菌都具有氧化多胺的能力。4.ABA处理茶树水培扦插苗,qPCR检测结果表明,CsPAOs基因家族对ABA胁迫的响应呈现出明显的差异变化,叶部CsPAO2在处理24h后增加到16倍;CsPAO1,CsPAO3,CsPAO6,CsPAO7略有上调;而CsPAO5在ABA处理下表达量下调。LC-MS/MS检测结果表明,ABA处理后的茶苗根与叶中检测出三种多胺,其中处理6h后Put达到最高0.70μg/g;Spd的变化与Put相类似;Spm(spermin,精胺)含量为 5.26μg/g-7.91μg/g。利用N2及CO2两种惰性气体处理采摘后茶树叶片,检测到两种多胺Put与Spd,其中Put在CO2和N2处理6h后分别达到0.3μg/g和0.85μg/g;而Spd的含量在厌氧胁迫处理后呈现先下降后上升的趋势,CO2和N2处理6h后分别达到0.97μg/g和1.25μg/g。相关基因除CsPAO6出现处理后上调之外,均呈现出下调的趋势。对厌氧处理后的茶树离体叶片进行38种氨基酸含量检测,结果表明,厌氧导致GABA含量急剧增加,更多源于谷氨酸脱羧,结合精氨酸与鸟氨酸含量变化,表明多胺在厌氧过程中更多参与尿素的代谢途径,离体条件下多胺氧化途径并不是GABA合成的主要途径。
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