在全世界范围内,猪的腹泻相关病毒严重制约了猪群的健康生长,造成了养猪业难以估量的亏损,其中以猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪A群轮状病毒（PoRV）以及猪δ冠状病毒（PDCoV）较为常见。而目前针对这四种腹泻病毒的鉴定主要以单一 RT-PCR技术较常见,虽然该技术具有一定特异性和便捷性,但是在针对大规模流行病学调查的时候,则暴露出时间长及费人力的缺点。本研究建立了一种可以同时鉴定出四种病毒（PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV）的四重RT-PCR检测方法,经过初步的实验室临床应用,证明了本检测方法可靠性和灵敏性高,且特异性好。研究通过NCBI下载PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV各自的国内外流行毒株的基因序列,通过DNAMAN、MEGA6等生物软件,选定稳定基因序列设计了四对特异性引物,并分别优化了退火温度、酶浓度等参数。经特异性验证,证明检测方法特异性良好。本实验构建了四种病毒的重组质粒,实验结果显示,PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的单一 RT-PCR检测体系的最低检测限分别为1.1×102、9.8×102、0.11×103、1.26×103copies/μL,具有较高的敏感性。在PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的单项RT-PCR检测体系的基础上,开展了 PEDV\PoRV、PEDV\TGEV、PEDV\PDCoV、PoRV\TGEV、PoRV\DCoV、PDCoV\TGEV六种二重RT-PCR检测体系的构建,对退火温度进行优化,证明了所建立的体系对退火温度的不敏感性,在四种退火温度条件下都可以进行有效的扩增。在二重RT-PCR检测技术研究的基础上,建立PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV四重RT-PCR检测方法,并对退火温度进行梯度性探索,确定了以54℃作为最终退火反应温度,随后优化了引物浓度和酶浓度,经特异性验证后,对本四重RT-PCR检测方法进行灵敏性实验,实验证明PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV四重RT-PCR检测方法对四种病毒最低检测限分别为:7.83 × 103、1.82 × 103、8.5× 103 和 8.4× 103copies/μL。将建立好的四重RT-PCR方法进行临床应用,结果与单项RT-PCR检测结果进行对比,PoRV检测结果与PoRV单项RT-PCR检测结果一致,符合率100%,PEDV、TGEV、PDCoV的检测结果,略低于这三种病毒的单项RT-PCR检测结果。试验检测了 187份临床样本,结果显示PEDV 阳性率8%;TGEV 阳性率3.7%;PoRV 阳性率 2.1%;PDCoV 阳性率 1.6%。